人乳頭瘤狀病毒16/18型蛋白E6及P53蛋白在宮頸癌前病變中的表達(dá)及相關(guān)性分析

李欣, 李清虹

在世界范圍內(nèi),宮頸癌發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的第二位,原位癌高發(fā)年齡為30～35歲,浸潤癌高發(fā)年齡為45～55歲，高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌的主要危險因素,臨床研究已經(jīng)證實超過90%的宮頸癌伴有高危型HPV感染[1-2],其中HPV16、18型是引起宮頸癌最多的病毒類型,超過70%[3]。對HPV進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),E6蛋白在阻止細(xì)胞凋亡和分化,控制細(xì)胞形狀和信號傳導(dǎo)方面起重要作用[4]。P53基因在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因中處于比較重要的地位,對細(xì)胞的生長具有負(fù)調(diào)控的作用[5]。有研究認(rèn)為,HPV16型和HPV18型的早期蛋白E6與P53蛋白的相互作用是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[6]。但是宮頸癌前病變中二者的表達(dá)和相互關(guān)系的研究較少,為此我們進(jìn)行了相關(guān)研究,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織標(biāo)本選自滄州市人民醫(yī)院2017年1月至2018年8月經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)病理確診為不典型增生宮頸組織蠟塊120例,其中輕度不典型增生(CIN Ⅰ級)組34例,中度不典型增生(CIN Ⅱ級)組44例,重度不典型增生(CIN Ⅲ級)組42例。另選擇因子宮肌瘤行子宮全切或次全切除標(biāo)本中正常宮頸組織蠟塊40例作為對照組。

1.2 免疫組化檢測HPV 16/18型E6蛋白及P53蛋白表達(dá) LSAB Lit和P53蛋白單克隆抗體(DO-7)購自DAKO公司;HPV 16/18型E6蛋白單克隆抗體(DP-12)購自O(shè)ncogen Science公司;SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司;SABC免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。病理組織蠟塊切片,68 ℃烤片12 h,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,放置于98 ℃ EDTA緩沖液中煮沸3 min,自然冷卻20 min,冷水沖洗高壓鍋至室溫,PBS沖洗3次,每次2 min,以修復(fù)抗原。阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗,室溫放置3 h,使用PBS沖洗3次,每次2 min,滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次,每次2 min,給予DAB反應(yīng)染色,常規(guī)脫水,透明、干燥、封片。

1.3 結(jié)果判定 E6及P53蛋白定位于細(xì)胞核上,出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)量<10%為(-),10%～25%為(+),26%～50%為(++),>50%為(+++)。所有標(biāo)本均給予免疫組化檢查,每份標(biāo)本分為兩份,分別測定HPV16/18 E6蛋白及P53蛋白。觀察4組的HPV16/18 E6蛋白、P53蛋白的表達(dá)情況。請兩位資深技師分別對結(jié)果進(jìn)行判定,如果結(jié)論不一致則協(xié)商確定。

2 結(jié)果

2.1 各組間HPV16/18 E6蛋白表達(dá)情況的比較

CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組之間HPV16/18 E6蛋白陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中CIN Ⅰ級組、CIN Ⅱ級組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.007,P=0.934);CIN Ⅰ級組低于CIN Ⅲ級組(χ2=3.866,P=0.049);CIN Ⅱ級組低于CIN Ⅲ級組(χ2=3.965,P=0.046),詳見表1。

表1 CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組間HPV16/18 E6蛋白表達(dá)的比較

2.2 各組間P53蛋白表達(dá)情況的比較 CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組的P53蛋白陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中對照組P53蛋白陽性表達(dá)率最高為72.50%,CIN Ⅲ級組P53蛋白陽性表達(dá)率最低為14.29%,詳見表2。

表2 CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組間P53蛋白表達(dá)的比較

注:CIN Ⅰ級組與CIN Ⅱ級組比較(χ2=0.117,P=0.733);CIN Ⅰ級組與CIN Ⅲ級組比較(χ2=9.812,P=0.002);CIN Ⅰ級組與對照組比較(χ2=4.992,P=0.025);CIN Ⅱ級組與CIN Ⅲ級組比較(χ2=8.702,P=0.003);CIN Ⅱ級組與對照組比較(χ2=7.354,P=0.007);CIN Ⅲ級組與對照組比較(χ2=28.380,P<0.001)

2.3 各組間HPV16/18 E6、P53陽性表達(dá)的相關(guān)性分析 CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組患者P53陽性表達(dá)在HPV16/18 E6的陽性表達(dá)中的占比存在組間差異,其中對照組為100.00%,高于其他組別,CIN Ⅲ級組最低為21.05%,見表3。使用Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示,HPV16/18 E6陽性表達(dá)和P53陽性表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.724,P=0.037)。

表3 CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組P53陽性表達(dá)在HPV16/18 E6陽性表達(dá)中的占比

注:CIN Ⅰ級組與CIN Ⅱ級組比較(χ2=0.180,P=0.671);CIN Ⅰ級組與CIN Ⅲ級組比較(χ2=10.296,P=0.001);CIN Ⅰ級組與對照組比較(χ2=1.732,P=0.189);CIN Ⅱ級組與CIN Ⅲ級組比較(χ2=9.385,P=0.002);CIN Ⅱ級組與對照組比較(χ2=0.749,P=0.387);CIN Ⅲ級組與對照組比較(χ2=3.419,P=0.047)

3 討論

宮頸癌一直是臨床研究的熱點課題之一。宮頸重度上皮內(nèi)瘤樣變是宮頸癌的癌前病變,但具有可逆性,一部分病變能夠自然消失,而另一部分病變可能發(fā)展成為宮頸癌[7-8]。輕度(CIN Ⅰ級)和中度(CIN Ⅱ級)上皮內(nèi)瘤樣變自然消失的概率要高于重度(CIN Ⅲ級),因此對于CIN Ⅲ級患者的早期診斷就成為改善預(yù)后的關(guān)鍵[9]。但是宮頸癌前病變患者通常無明顯癥狀,或者僅有一般的宮頸炎癥狀,如白帶增多,或白帶帶血、性接觸后出現(xiàn)少量陰道流血的癥狀[10]。這些癥狀均非特異性,病理檢查如果不能取到病變部位則有一定的誤診率和漏診率。近年來基因?qū)哟窝芯繛檫@一問題的解決提供了新途徑[11]。

HPV是最廣泛的性傳播病毒,其病毒的變種超過100種,而高風(fēng)險亞種主要為16、18、31、33、35、45、52、58型[12]。宮頸癌的發(fā)生與HPV感染高度相關(guān)。雖然有80%以上的經(jīng)產(chǎn)婦有過HPV感染病史,但絕大部分能夠經(jīng)免疫系統(tǒng)將病毒清除而得以自愈,僅極少數(shù)E6、E7蛋白高表達(dá)的患者最終發(fā)展成為宮頸癌。HPV的基因已經(jīng)被掌握,是無外殼的dsDNA病毒,其基因組為環(huán)狀結(jié)構(gòu),共由8種蛋白組成,包括6個早期蛋白和2個晚期蛋白。早期蛋白能夠調(diào)控基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能,其中E6蛋白分為5個功能區(qū),與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和致瘤性密切相關(guān),在病毒的復(fù)制中具有關(guān)鍵作用,能夠阻止細(xì)胞凋亡和分化,控制細(xì)胞形狀和信號傳導(dǎo)。E6蛋白引起細(xì)胞異常的途徑通常有3條,其中最顯著的功能是通過與E6蛋白結(jié)合蛋白的結(jié)合而促進(jìn)P53的失活和降解,其次是介導(dǎo)人類端粒酶,最后是通過靶向含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白。P53基因是人體的抑癌基因,其中含有大量的脯氨酸,其野生型能使細(xì)胞凋亡,幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷,從而防止癌變,已經(jīng)證實該基因的失活對腫瘤的形成具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組之間HPV16/18 E6蛋白的陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中CIN Ⅰ、Ⅱ級組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),CIN Ⅰ、Ⅱ級組的HPV16/18 E6蛋白陽性表達(dá)率均明顯低于CIN Ⅲ級組(P<0.05)。說明E6蛋白在宮頸癌前病變中起到重要作用,其變化水平在CIN Ⅲ級組中顯著升高,因此可作為宮頸癌前病變的診斷指標(biāo)之一。此外,CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級組與對照組之間P53蛋白的陽性表達(dá)率也有明顯差異,其中對照組的陽性表達(dá)率最高,為72.50%,CIN Ⅲ級組陽性表達(dá)率最低,為14.29%。說明p53蛋白在宮頸癌前病變的發(fā)生發(fā)展中起到抑制作用,E6蛋白結(jié)合蛋白與E6相結(jié)合能夠促進(jìn)p53的失活和降解,而E6蛋白的升高也可能是抑制宮頸癌前病變發(fā)展的因素。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,E6蛋白的陽性表達(dá)和P53蛋白的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.724,P=0.037)。

綜上所述,在宮頸癌前病變中HPV16/18 E6蛋白與宮頸癌前病變的發(fā)生密切相關(guān),或可作為宮頸癌診斷的指標(biāo)之一;而P53蛋白對抑制宮頸癌的發(fā)生具有重要作用。