結(jié)直腸癌中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表達及臨床意義

李想才, 金川

遺傳易感性、環(huán)境及老齡均是結(jié)直腸癌危險因素[1]。與其他惡性腫瘤類似,結(jié)直腸癌病死率高的重要原因是生長迅速、浸潤性強且易轉(zhuǎn)移，目前的主要治療手段是在手術(shù)的基礎上輔以放化療,但仍有腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移,預后不良[2]。因此早期診斷及對患者預后的研究具有重要的現(xiàn)實意義。分子遺傳學和生物學的發(fā)展使越來越多的潛在致病基因被發(fā)現(xiàn)。GOLPH3可與逆向囊泡轉(zhuǎn)運復合物相互作用,促進癌細胞增殖[3]。近年來提出“信號/歸巢”的假說,即在配體的牽引下高表達的特定腫瘤趨化因子受體細胞會轉(zhuǎn)移到相對應的靶器官中形成轉(zhuǎn)移灶,使腫瘤細胞不斷生長和增殖。CXCL12作為趨化因子,它可以在許多組織(包括腦、胸腺、心、肺、肝、腎、骨髓、脾臟)中表達,趨化因子CXCL12的受體是CXCR4,但最近有研究認為CXCL12還可以與CXCR7受體結(jié)合,且其結(jié)合力約是CXCL12/CXCR4趨化軸的10倍。本研究通過采用免疫組化法和Western blot法檢測結(jié)直腸癌組織中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表達,探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣東省惠州市中心醫(yī)院博羅分院2017年4月到2018年9月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌患者60例,包括35例男性,25例女性,年齡24～83歲,其中結(jié)腸癌24例,直腸癌36例;另取癌旁60例正常大腸黏膜組織(距結(jié)直腸癌遠端≥10 cm,經(jīng)診斷無癌組織浸潤)做對照組。所有研究對象均接受規(guī)范化治療;病歷資料完整;所有標本均在離體30 min內(nèi)采集。排除良性結(jié)直腸腫瘤者;患有嚴重基礎疾病者;資料不完整者。研究方案經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準,并與患者簽訂知情同意書。

1.2 檢測方法免疫組化法 采用SP兩步法檢測60例結(jié)直腸癌組織以及60例正常黏膜大腸組織，操作嚴格按照說明書進行，石蠟切片，二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化，檸檬酸高溫修復抗原，過氧化氫室溫孵育 10 min，封閉過氧化物酶，加入兔抗人GOLPH3、CXCR7、CXCL12多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫，PBS 沖洗 3 遍，二抗 37 ℃孵育 30 min，PBS 沖洗 3 遍，DAB 顯色，蘇木素復染，自來水沖洗后藍化，乙醇脫水，最后中性樹膠封片。

Western blot法:取-80 ℃冰箱中新鮮結(jié)直腸癌組織提取總蛋白,用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,放入含5%脫脂奶粉的TBST進行封閉,37 ℃保溫箱90 min;在裝有一抗封閉液的雜交袋中過夜,采用TBST液洗膜5次,每次8 min;加二抗封閉液封閉PVDF膜,37 ℃孵育2 h后曝光,觀察結(jié)果。采用Lab Works 4.5分析系統(tǒng)軟件(美國UVP公司)對Western條帶進行定量分析,各組目的蛋白的相對表達水平。

1.3 結(jié)果判斷 GOLPH3免疫組化陽性主要定位于細胞漿,以癌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒沉著者為GOLPH3表達陽性。CXCR7和CXCL12免疫組化陽性主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)中,以癌細胞胞膜和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒沉著者為CXCR7、CXCL12表達陽性。每張切片隨機選取5個視野,計數(shù)500個細胞,根據(jù)染色強度及陽性細胞數(shù)的百分率評分進行分級,兩項評分之和>2分即為陽性,≤2分則計為陰性。細胞染色強度計分:無染色0分;出現(xiàn)淡黃色顆粒沉著且強度明顯高于背景1分;出現(xiàn)棕黃色顆粒2分;出現(xiàn)大量棕褐色顆粒3分。陽性細胞百分率計分:陽性細胞數(shù)≤5%為0分;5%﹤陽性細胞數(shù)≤25%為1分;25%﹤陽性細胞數(shù)≤50%為2分;陽性細胞數(shù)﹥50%為3分。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 在結(jié)直腸癌組織和正常黏膜組織中GOLPH3、CXCR7、CXCL12的表達 見圖1。GOLPH3在結(jié)直腸癌組織和正常大腸組織中的陽性表達率分別為53.3%(32/60)和21.7%(13/60),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CXCR7在結(jié)直癌組織和正常組織中的陽性率分別為66.7%(40/60)和41.7%(25/60),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CXCL12在結(jié)直腸癌組織和正常大腸組織中的陽性表達率分別為78.3%(47/60)和5%(3/60),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表1。

表1 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(%)

2.2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表達率與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在結(jié)直腸癌患者中,GOLPH3、CXCL12陽性表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05);CXCR7陽性表達率與分化程度、TNM分期、病理類型有關(guān)(P<0.05),詳見表2。

1A為GOLPH3在結(jié)直腸癌組織中的表達,圖中細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒沉著;1C為CXCR7在結(jié)直腸癌組織中的表達,圖中細胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒;1E為CXCL12在結(jié)直腸癌組織中的表達,圖中細胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒沉著。1B、1D、1F分別代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12在正常大腸組織中的表達,呈陰性圖1 GOLPH3、CXCR7和CXCL12蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達

表2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系[例(%)]

2.3 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在結(jié)直腸癌組織中蛋白免疫印跡(Western blot)檢測結(jié)果 GOLPH3蛋白在結(jié)直腸癌組織中的相對表達強度為(34.95±8.11)高于正常大腸組織中的相對表達強度(11.67±5.23),差異有統(tǒng)計學意義(t=-10.79,P<0.001);CXCR7蛋白在結(jié)直腸癌組織中的相對表達強度為(67.56±16.01)高于正常大腸組織中的相對表達強度(24.00±16.43),差異具有統(tǒng)計學意義(t=-9.57,P<0.001);CXCL12蛋白在結(jié)直腸癌組織中的相對表達強度為(87.00±18.23),高于正常大腸組織中的相對表達強度(28.92±10.13),差異具有統(tǒng)計學意義(t=-12.46,P<0.001)，詳見圖2。

注：2A中 1、3、5分別代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達,2、4、6分別代表GOLPH3、CXCR7、CXCL12蛋白在癌旁正常大腸組織中的表達;2B為內(nèi)參GAPDH圖2 GOLPH3、CXCR7和CXCL12蛋白免疫印跡(Western blot)檢測結(jié)果

2.4 GOLPH3、CXCR7和CXCL12在結(jié)直腸癌表達中的相互關(guān)系 采用Spearman等級相關(guān)分析表明,GOLPH3與CXCL12蛋白在大腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.42,P=0.002),CXCR7和CXCL12蛋白在大腸癌組織中呈正相關(guān)(r=0.44,P=0.010)。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是內(nèi)因和外因即基因和環(huán)境相互作用后產(chǎn)生的結(jié)果,其中原癌基因的激活被認為是促發(fā)結(jié)直腸癌的關(guān)鍵機制之一。當前,藥物靶向直接針對癌細胞的治療手段受到廣泛臨床工作者的關(guān)注,分子靶向治療成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。在惡性腫瘤的增殖過程中,某些原癌基因的激活或抑癌基因的失活導致了腫瘤細胞中特定蛋白的異常表達[3],因此,探索特定蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中表達變化,對于腫瘤的診斷及靶向藥物的開發(fā)意義重大。本文采用免疫組化和Western blot法檢測結(jié)直腸癌患者組織GOLPH3、CXCR7和CXCL12的表達,分析了三種標志物的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明,GOLPH3、CXCR7、CXCL12在結(jié)直腸癌癌組織中高表達,而在正常的癌旁大腸組織中不表達或微表達,在結(jié)直腸癌患者中,三種標志物與某些臨床病理特征關(guān)系密切,提示GOLPH3、CXCR7和CXCL12可能參與了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的過程。

GOLPH3主要富集在高爾基體囊泡反面的膜外圍,也存在于小管、囊泡、內(nèi)腔和質(zhì)膜中,主要發(fā)揮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的作用[4]。2009年,在細胞生物學和生物化學領(lǐng)域, GOLPH3被認為是一個致癌基因[5-6]。現(xiàn)國內(nèi)外文獻已有報道GOLPH3在前列腺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食管癌等多種腫瘤中高表達,而在正常組織中無表達或低表達[7-10]。本實驗免疫組化和Western blot檢測結(jié)果均顯示在結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的陽性率和蛋白表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05),表明GOLPH3可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中起重要作用。有文獻指出GOLPH3通過調(diào)節(jié)糖基化轉(zhuǎn)移酶從而引起糖基化蛋白的分泌失常[11]。而目前已證實腫瘤細胞的生長、粘附、遷移與侵襲以及免疫識別與糖基化結(jié)構(gòu)密切相關(guān),糖基化結(jié)構(gòu)的異常變化會導致腫瘤的侵襲性增加,因此GOLPH3在一定程度上可間接影響腫瘤細胞。本研究在GOLPH3與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征的分析中發(fā)現(xiàn)GOLPH3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時表達率會升高,說明GOLPH3在一定程度上可反映出結(jié)直腸癌的惡性程度,可作為結(jié)直腸癌生物學行為的指標。

一直以來,炎性反應趨化因子在腫瘤細胞生長、遷移過程中起著重要的作用,同時還影響免疫細胞對腫瘤細胞的滲入[12]。在腫瘤細胞表達的相應受體介導下,炎性反應趨化因子能對特定器官合成的同源配體進行應答,然后腫瘤細胞通過趨化因子濃度梯度進行遷移[13]。CXCL12屬于趨化因子家族成員之一,又稱基質(zhì)細胞源性因子-1,是一種多效性的趨化因子,在腦、肺、結(jié)腸、心臟和肝臟等組織中廣泛表達,能刺激多種信號轉(zhuǎn)導。CXCR7作為與細胞膜相關(guān)受體之一,在正常細胞中表達較少,但在腦源性神經(jīng)元、活化內(nèi)皮細胞等細胞中高表達。在腫瘤細胞增殖過程中,CXCR7作為CXCL12的一種新型受體, CXCL12/CXCR7生物軸與CXCL12/CXCR4有類似的生物效應[14-16]。現(xiàn)有研究表明CXCR7蛋白在肺癌、前列腺癌等腫瘤細胞中起著促進其增殖、抑制死亡等作用,它的高表達可能在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了重要作用,但其在結(jié)直腸癌領(lǐng)域的研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn),CXCL12和CXCR7在結(jié)直腸癌組織中表達率高于癌旁正常組織(P<0.05),研究中CXCR7在結(jié)直腸癌中的高表達與病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān),CXCL12在結(jié)直腸癌組織中的高表達則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示二者可作為判斷結(jié)直腸癌有無淋巴轉(zhuǎn)移的生物學標志物,同時CXCR7還與其他病理特征密切相關(guān),提示二者聯(lián)合檢測能促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等。本研究結(jié)果還顯示,GOLPH3與CXCL12、CXCL12與CXCR7呈正相關(guān),有文獻指出在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中GOLPH3、CXCR7、CXCL12與mTOR信號通路有關(guān),并上調(diào)VEGF表達,對腫瘤發(fā)展起到促進作用,由此可以預測三者的聯(lián)合檢測等進一步研究,可以指導臨床運用。

綜上所述,GOLPH3、CXCR7和CXCL12在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中起協(xié)調(diào)作用,GOLPH3、CXCR7和CXCL12表達的升高預示腫瘤有高度侵襲性、高度轉(zhuǎn)移性潛能,進一步探究三者的作用及相互關(guān)系有助于闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機制,為提供結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移基因標記物及靶向治療提供新思路。