郭 紅 邱 月 魏建平 張宇翔 袁亞宏 岳田利,

(1.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 西安 710069； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100)

0 引言

細(xì)胞暴露于非理想的生長(zhǎng)條件及任何降低細(xì)胞活力或適應(yīng)性的環(huán)境都可以被認(rèn)為是壓力[1]。高滲壓力是一大類(lèi)主要的非生物壓力[2]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一種溫和耐滲酵母，已成為研究滲透壓耐受性的模型菌株。目前，對(duì)于釀酒酵母耐滲機(jī)理的研究主要集中在高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(High-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase, HOG-MAPK)途徑[2-4]，通過(guò)甘油的產(chǎn)生調(diào)節(jié)滲透壓平衡[5-6]。HOG-MAPK途徑中的細(xì)胞膜傳感器感知壓力信號(hào)，將壓力信號(hào)傳輸至Hog1激酶，Hog1磷酸化(Hog1-PP)后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[4]。在0.2 g/mL糖脅迫下的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表明，釀酒酵母誘導(dǎo)了與壓力反應(yīng)途徑、修復(fù)途徑和HOG途徑有關(guān)的基因[7]。在0.4 g/mL糖壓力下，釀酒酵母增加了糖酵解和戊糖途徑等相關(guān)基因的表達(dá)[8]。在0.6 g/mL的糖脅迫下，釀酒酵母誘導(dǎo)了半胱氨酸蛋白酶和線粒體依賴性凋亡[9]，但是在此條件下，釀酒酵母細(xì)胞壁(膜)的變化與分子機(jī)制尚不清楚。此外，釀酒酵母還是一種可揭示與高滲壓力變化有關(guān)的病理特征(例如缺血和糖尿病昏迷)的模型菌株[4,9]，高滲應(yīng)激也能誘導(dǎo)人細(xì)胞系凋亡[10]。

細(xì)胞壁是細(xì)胞在壓力下存活所必需的。在高滲壓力下，一方面，酵母轉(zhuǎn)向更低滲透壓環(huán)境會(huì)增加細(xì)胞體積，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，為了抵消這種壓力，酵母細(xì)胞壁具有保護(hù)細(xì)胞膜免于被爆裂的作用。另一方面，高滲透壓會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)的水流出和細(xì)胞收縮，且會(huì)造成多種細(xì)胞生物過(guò)程的破壞，例如破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、觸發(fā)細(xì)胞周期停滯和凋亡[6]。然而，釀酒酵母細(xì)胞表面響應(yīng)在極端高糖壓力的應(yīng)對(duì)機(jī)制尚不清楚。為此，本文比較研究釀酒酵母細(xì)胞壁(膜)在高糖壓力下的變化，并通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄文件對(duì)其進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(ATCC38531)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖降解酶購(gòu)自上海源葉公司；D-葡糖胺、4-二甲基氨基苯甲醛、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH值 7.2～7.4)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑(Calcofluor white stain, CFW)、碘化丙啶(PI)和赫斯特?zé)晒馊剂?3342(Hoechst 33342)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、蛋白胨、D-(+)-葡萄糖和多肽購(gòu)自當(dāng)?shù)毓?yīng)商。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

釀酒酵母ATCC38531在YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)肉湯中30℃培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物處于指數(shù)后期(菌體濃度約1×108CFU/mL)。然后使用YPD培養(yǎng)基(0.02 g/mL葡萄糖)作為基礎(chǔ)和無(wú)應(yīng)激培養(yǎng)基，使用60%YPD(0.6 g/mL葡萄糖)作為高糖培養(yǎng)基[11]。取20 mL培養(yǎng)至指數(shù)后期的釀酒酵母(菌體濃度約2×109CFU/mL)接種到60%YPD培養(yǎng)基中，至菌體濃度為2×107CFU/mL，然后30℃適應(yīng)4 h。將分別在YPD培養(yǎng)基和60%YPD培養(yǎng)基中適應(yīng)4 h的釀酒酵母細(xì)胞洗滌并重懸于PBS中，并作為對(duì)照組的樣品和高滲脅迫處理組的樣品。

1.3 細(xì)胞壁特性變化分析

1.3.1細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和β-葡聚糖含量測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法分離對(duì)照組和處理組釀酒酵母的細(xì)胞壁并定量測(cè)定細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和β-葡聚糖的含量。

1.3.2細(xì)胞壁染色

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法進(jìn)行酵母細(xì)胞的CFW染色試驗(yàn)。將2 μL CFW染色的細(xì)胞上樣到載玻片上，在頂部添加蓋玻片，使用Andor CSU-W型共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

1.3.3細(xì)胞壁酶解

根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法，選擇葡聚糖特異性降解酶對(duì)對(duì)照組細(xì)胞和高濃度葡萄糖處理組的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞壁的降解試驗(yàn)，從而對(duì)細(xì)胞壁的靈敏性進(jìn)行分析。將對(duì)照組和高濃度葡萄糖處理組的細(xì)胞用超純水洗滌，分別在NaH2PO4(0.1 mol/L)、0.04%NaN3和40 μg/mL降解酶的緩沖液中稀釋至細(xì)胞在660nm處OD值為0.73。每小時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞濃度的變化并測(cè)定對(duì)照組和高濃度葡萄糖處理組的酵母細(xì)胞酶解后的OD值，重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞膜的PI和Hoechst 33342雙染試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法并做了一些改進(jìn)，進(jìn)行釀酒酵母細(xì)胞膜完整性分析的雙染試驗(yàn)。染色試驗(yàn)需要添加至少0.1 μg/μL PI和10 μg/μL Hoechst 33342。細(xì)胞染色處理后在熒光顯微鏡(德國(guó)Lecia公司)下觀察酵母細(xì)胞。

1.5 RNA提取的樣品制備

RNA提取的樣品為分別在YPD培養(yǎng)基和60%YPD培養(yǎng)基中適應(yīng)4 h的釀酒酵母細(xì)胞，即對(duì)照組的樣品和高滲脅迫處理組的樣品。每個(gè)樣品重復(fù)3次，收集所有樣品，隨后用液氮快速冷凍并在-80℃下儲(chǔ)存，用于RNA提取。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析

RNA的提取準(zhǔn)備、RNA質(zhì)量檢測(cè)、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和RNA測(cè)序在北京諾禾公司進(jìn)行。按照TRIzol試劑的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并用無(wú)RNase的DNA酶I處理。使用NanoDrop型分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)、Qubit 2.0型熒光計(jì)(美國(guó)Life Technologies公司)、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100型生物分析儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)測(cè)定RNA樣品的濃度、純度和完整性[11，16]。根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并在Illumina Hiseq 2000平臺(tái)(美國(guó)San Diego公司)上測(cè)序。

1.7 差異表達(dá)基因鑒定

從對(duì)照組和處理組樣品中測(cè)序并產(chǎn)生原始讀數(shù)。通過(guò)過(guò)濾銜接子序列獲得高質(zhì)量的RNA-Seq純凈序列讀數(shù)。通過(guò)HISAT 2.0將釀酒酵母的純凈序列讀數(shù)與釀酒酵母S288C的參考基因組比對(duì)。通過(guò)HTSeq v0.6.1量化基因表達(dá)值。DESeq v1.10.1用于確定對(duì)照組和處理組樣品之間的差異表達(dá)基因(DEG)。如果基因變化倍數(shù)以2為底的對(duì)數(shù)值大于0且顯著性p<0.05，則認(rèn)為基因顯著差異表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，通過(guò)GOSeq Release 2.12進(jìn)行DEG的GO富集分析。本試驗(yàn)測(cè)定的RNA-seq數(shù)據(jù)已經(jīng)存入國(guó)家生物技術(shù)信息中心，登錄號(hào)為PRJNA437612。

2 結(jié)果及分析

2.1 極端高糖壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁的影響

為探索釀酒酵母在極端高糖條件下細(xì)胞壁特性的變化，測(cè)定了對(duì)照組和高糖壓力處理組釀酒酵母細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和葡聚糖的含量。如圖1a所示，釀酒酵母細(xì)胞壁在高糖壓力下適應(yīng)4h后幾丁質(zhì)含量(質(zhì)量比，以每毫克干細(xì)胞壁質(zhì)量計(jì))從6 μg/mg增加到6.9 μg/mg，葡聚糖含量從128 μg/mg增加到138 μg/mg。如圖1b、1c所示，相比對(duì)照組細(xì)胞，處理組的釀酒酵母細(xì)胞對(duì)CFW染料的結(jié)合顯示出高靈敏性，并且CFW染色的高靈敏性主要富集在芽頸的區(qū)域。此外，如圖1d所示，處理組的細(xì)胞在降解酶處理3 h后細(xì)胞濃度(660 nm處OD值)有49%的下降，而對(duì)照組僅有25%的下降，這說(shuō)明了經(jīng)過(guò)高糖壓力處理的釀酒酵母的細(xì)胞壁更易受到葡聚糖特異性降解酶的降解。以上的現(xiàn)象可能是因?yàn)獒劸平湍冈诟咛菈毫ο录?xì)胞壁葡聚糖-幾丁質(zhì)層遭到了損傷或者破壞。

2.2 極端高糖壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜的影響

為研究極端高糖壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜的影響，進(jìn)行雙染試驗(yàn)來(lái)區(qū)分細(xì)胞膜完整的細(xì)胞和細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞[13,15]。PI染料不可滲入具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞，但它可以容易地滲入到細(xì)胞膜受損的細(xì)胞中并使該細(xì)胞染色，而留下具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞未被染色。而細(xì)胞膜完整和細(xì)胞膜受損的細(xì)胞都可以被細(xì)胞穿透性染料Hoechst 33342染色。熒光圖像結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)0.6 g/mL高糖壓力分別處理4 h和8 h的部分細(xì)胞能被PI染料染成紅色而對(duì)照組的細(xì)胞未被PI染料染色，這說(shuō)明高濃度葡萄糖處理的細(xì)胞細(xì)胞膜受到了損傷(圖2)，而對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞膜未受到損傷。

圖2 高滲脅迫對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜完整性的影響Fig.2 Effects of high sugar stress on integrity of cell membrane

2.3 釀酒酵母細(xì)胞的RNA測(cè)序結(jié)果

為解釋以上發(fā)現(xiàn)，對(duì)對(duì)照組細(xì)胞和處理組細(xì)胞進(jìn)行了全局的RNA-seq測(cè)序。差異基因火山圖如圖3所示，有顯著性差異表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)(上調(diào))和綠色點(diǎn)(下調(diào))表示，無(wú)顯著性差異表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示。本試驗(yàn)中鑒定出釀酒酵母在適應(yīng)0.6 g/mL極端高糖壓力下上調(diào)表達(dá)的1 959個(gè)和下調(diào)表達(dá)的1 955個(gè)基因(DEGs)(圖3)。這個(gè)基因數(shù)量要顯著多于釀酒酵母在應(yīng)對(duì)0.2 g/mL糖質(zhì)量濃度下獲得的294個(gè)差異基因[7]和釀酒酵母在應(yīng)對(duì)0.4 g/mL糖質(zhì)量濃度條件下獲得的589個(gè)差異基因[8]。由此可以看出，釀酒酵母隨著環(huán)境糖濃度的增加，差異表達(dá)的基因也增加。這可能是因?yàn)殡S著環(huán)境壓力的增加，細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的調(diào)節(jié)機(jī)制變得更復(fù)雜。為此，本文著重關(guān)注與表型結(jié)果相關(guān)的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的DEGs。

圖3 差異基因火山圖Fig.3 Volcano diagram of DEGs

2.4 極端高糖壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜代謝途徑的影響

本研究觀察到與細(xì)胞膜相關(guān)的脂肪酸/不飽和脂肪酸合成、脂肪酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸延長(zhǎng)等途徑在極端高糖壓力下均發(fā)生了顯著變化(表1、圖2)。這說(shuō)明0.6 g/mL高糖壓力可能通過(guò)干預(yù)脂肪酸的組成和含量來(lái)影響膜的流動(dòng)性或滲透性。文獻(xiàn)[19]表明脂肪酸通過(guò)改變膜的流動(dòng)性或滲透性來(lái)參與對(duì)外部應(yīng)激的反應(yīng)。

2.5 極端高糖壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響

極端高糖壓力誘導(dǎo)了釀酒酵母一系列與細(xì)胞壁組成和生物發(fā)生相關(guān)的基因的差異表達(dá)(表2)。細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)通路相關(guān)基因顯著的差異表

表1 與細(xì)胞膜相關(guān)的差異表達(dá)基因Tab.1 Differentially expressed genes associated with plasma membrane compartments and functions

達(dá)進(jìn)一步支持了從圖1中觀察到的細(xì)胞壁變化。釀酒酵母在高糖壓力下與細(xì)胞壁有關(guān)的一些關(guān)鍵信號(hào)基因(ROM1、PIR3、YGP1和CWP1)和主要轉(zhuǎn)錄因子RLM1被下調(diào)(表2、圖4d)。此外，RLM1的22個(gè)靶標(biāo)基因中有6個(gè)基因過(guò)表達(dá)，有6個(gè)基因被抑制，這些靶標(biāo)基因編碼與細(xì)胞壁組織和細(xì)胞壁生物發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖4d)。

表2 與細(xì)胞壁相關(guān)的差異表達(dá)基因Tab.2 Differentially expressed genes associated with cell wall compartments and functions

3 討論

膜外排泵在假單胞菌耐滲過(guò)程中起關(guān)鍵作用。細(xì)菌外排泵(AcrAB-TolC)在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境壓力的耐受性增加[14]。與細(xì)菌泵系統(tǒng)類(lèi)似，酵母細(xì)胞的排毒功能主要由多效藥物抗藥性(PDR)泵驅(qū)動(dòng)，PDR泵是酵母細(xì)胞膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette)的一個(gè)子家族[20]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)釋放細(xì)胞有害分子來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力[21]。在真菌擴(kuò)展青霉中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的下調(diào)表達(dá)降低了耐藥性[18]。釀酒酵母的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(YOR1和PDR15)在高糖脅迫下分別下調(diào)表達(dá)了2.8倍和2.0倍(表1)，這表明本研究使用的極端高滲壓力(0.6 g/mL糖)可能降低了釀酒酵母的排毒功能。0.6 g/mL高糖壓力還影響了釀酒酵母細(xì)胞膜上碳水化合物、異源蛋白和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性(表1)，這個(gè)結(jié)果與檸檬醛壓力對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響類(lèi)似[14]。麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的主要成分之一，它被認(rèn)為對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、滲透、生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要[18]。在本研究中，參與麥角固醇生物合成的大多數(shù)基因(ERG1～4)的表達(dá)水平被上調(diào)(表1)，這說(shuō)明釀酒酵母在0.6 g/mL高糖壓力下可能增加合成麥角固醇，這與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的魯氏接合酵母通過(guò)上調(diào)麥角固醇合成的相關(guān)基因來(lái)應(yīng)對(duì)高滲壓力類(lèi)似。麥角固醇與脂肪酸兩者比例的變化已被報(bào)道影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性[2]，這也進(jìn)一步說(shuō)明0.6 g/mL高糖壓力影響細(xì)胞膜流動(dòng)性，但是細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)細(xì)胞響應(yīng)高滲壓力的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。此外，如圖5所示，GO分析前30條下調(diào)的GO分類(lèi)，縱坐標(biāo)表示GO術(shù)語(yǔ)，橫坐標(biāo)表示每個(gè)GO術(shù)語(yǔ)的差異基因數(shù)量，“*”顯示顯著性，觀察到多達(dá)393個(gè)DEGs富集在膜組分GO分類(lèi)上且均被下調(diào)(圖5)，這些DEGs可能在膜上發(fā)揮功能。上述細(xì)胞膜基因的顯著變化，結(jié)合試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸、麥角固醇等成分的基因在高滲脅迫下的差異表達(dá)，支持了雙染試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜損傷的現(xiàn)象(圖2)。

圖4 細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)通路在不同壓力下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.4 Cell wall integrity signaling pathway with transcriptomic expression changes during different stresses

圖5 GO功能分類(lèi)分析下調(diào)的差異基因Fig.5 GO functional classification of down-regulated DEGs

細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要[14]。它的晶格結(jié)構(gòu)通過(guò)纖維素和幾丁質(zhì)鏈之間強(qiáng)大的氫鍵網(wǎng)絡(luò)以及3個(gè)壁成分(葡聚糖、甘露糖蛋白和幾丁質(zhì))之間的共價(jià)糖苷鍵緊密地結(jié)合在一起。CFW是一種熒光染料，通過(guò)與幾丁質(zhì)和多糖之間的氫鍵結(jié)合到細(xì)胞壁[14]，但是在真菌中，CFW優(yōu)先結(jié)合位于細(xì)胞壁發(fā)芽頸中的幾丁質(zhì)[22]。在圖1b、1c的細(xì)胞壁CFW染色試驗(yàn)中，每個(gè)處理組的細(xì)胞數(shù)量相同，但是有更多的CFW染料與處理組的細(xì)胞結(jié)合，說(shuō)明高糖壓力處理的釀酒酵母對(duì)CFW敏感性增加。文獻(xiàn)[23-24]表明白色念珠菌、黑曲霉和許多其它真菌對(duì)CFW的敏感性增加表明細(xì)胞壁受損。以前的報(bào)道還表明幾丁質(zhì)聚合物的晶格結(jié)構(gòu)破裂會(huì)削弱細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯和幾丁質(zhì)在釀酒酵母細(xì)胞中的積累[24]，這種機(jī)制與結(jié)果中細(xì)胞幾丁質(zhì)含量增加(圖1a)和CFW敏感性增加(圖1c)的結(jié)果一致，而且與已報(bào)道的0.6 g/mL高糖壓力抑制釀酒酵母生長(zhǎng)的結(jié)果一致[2,9]。此外，在用極端高糖壓力處理釀酒酵母后，細(xì)胞壁對(duì)葡聚糖特異性裂解酶的降解更敏感，這表明釀酒酵母在極端高糖壓力下可能發(fā)生了去結(jié)晶作用(圖1)，推測(cè)釀酒酵母細(xì)胞壁相關(guān)的基因可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖-幾丁質(zhì)層[25]的交聯(lián)程度來(lái)應(yīng)對(duì)高滲壓力。

釀酒酵母在極端高糖壓力下的轉(zhuǎn)錄結(jié)果進(jìn)一步表明細(xì)胞壁正在承受壓力。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的13個(gè)差異表達(dá)基因(HSP12、CWP1、PIR3、CRH1、GFA1、PST1、SLT2、SRL3、MLP1、YPL0882、PRM5、YHR097C和FBP26)同屬于文獻(xiàn)[26]報(bào)道的一個(gè)包含20個(gè)特征基因的基因簇，這20個(gè)特征基因代表了細(xì)胞壁正在承受壓力的轉(zhuǎn)錄指紋圖譜，其中有一些特征基因直接參與細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)通路(圖4d)。在極端高糖壓力下，釀酒酵母抑制了細(xì)胞表面?zhèn)鬟f壓力信號(hào)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子ROM1(表1)，然后它下游的RLM1被抑制(表1)。RLM1的6個(gè)靶標(biāo)基因(PIR1、CWP1、PIR3、SPS100、FIT2和YGP1)下調(diào)表達(dá)，特別是細(xì)胞壁組織和穩(wěn)定性所必需的PIR3和YGP1分別下調(diào)了12.6倍和5.8倍(圖4d和表2)。研究表明RLM1是編碼負(fù)責(zé)輸出CWI大部分轉(zhuǎn)錄基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21]。圖4還顯示了釀酒酵母依賴RLM1調(diào)節(jié)的CWI信號(hào)傳導(dǎo)途徑在不同壓力因子下的差異調(diào)節(jié)。釀酒酵母在0.6 g/mL高糖壓力下生長(zhǎng)受到抑制甚至開(kāi)始凋亡[2,9]，在試驗(yàn)中(0.6 g/mL糖壓力下)RLM1轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達(dá)，同時(shí)也造成由RLM1轉(zhuǎn)錄的靶標(biāo)基因發(fā)生改變。釀酒酵母在0.2 g/mL 和0.4 g/mL糖質(zhì)量濃度下均生長(zhǎng)良好，并沒(méi)有發(fā)生RLM1轉(zhuǎn)錄因子的改變以及大多數(shù)由RLM1轉(zhuǎn)錄的靶標(biāo)基因的改變[7-8]，這些結(jié)果說(shuō)明了釀酒酵母在進(jìn)一步的糖壓力下RLM1被抑制并失去了維持細(xì)胞穩(wěn)定的能力。

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究測(cè)定了在0.6 g/mL極端高糖壓力下釀酒酵母細(xì)胞壁組分的變化，采用染色試驗(yàn)和酶降解試驗(yàn)研究了細(xì)胞壁(膜)的結(jié)構(gòu)變化，并通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄文件對(duì)發(fā)現(xiàn)的表型結(jié)果進(jìn)行分析討論。結(jié)果表明,在0.6 g/mL極端高糖壓力下，通過(guò)下調(diào)釀酒酵母與細(xì)胞壁完整性(CWI)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞膜成分相關(guān)的基因(ROM1、RLM1、PIR3、YGP1、CWP1、PDR15、YOR1等)，進(jìn)行細(xì)胞壁(膜)高滲損傷的應(yīng)激反應(yīng)，0.6 g/mL極端高糖壓力改變了釀酒酵母細(xì)胞壁特性和細(xì)胞膜流動(dòng)性。本文為進(jìn)一步研究釀酒酵母的高滲脅迫應(yīng)對(duì)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。