陶月，郭榮慧，范銘，吳恒梅，姜成

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

目前，土壤被重金屬污染的相關(guān)環(huán)境問(wèn)題吸引了人們的注意力。隨著逐年增長(zhǎng)的人口數(shù)量及迅速發(fā)展的經(jīng)濟(jì)，我國(guó)必須要面對(duì)愈發(fā)嚴(yán)重的土壤環(huán)境的安全問(wèn)題。據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)近2×107hm2的耕地面積已受到重金屬污染，約占全國(guó)總耕地面積的20%，被重金屬污染的糧食每年可達(dá)1.2×104萬(wàn)t，造成200億元的直接經(jīng)濟(jì)損失。如何安全高效的把重金屬污染的土壤修復(fù)，是我們的首要任務(wù)。植物修復(fù)作為重金屬污染治理技術(shù)，因其成本低、對(duì)土壤安全、無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的重視。尋找對(duì)重金屬污染耐受性較強(qiáng)的植物，是實(shí)現(xiàn)植物修復(fù)的前提條件，目前對(duì)重金屬研究多數(shù)集中在花卉和農(nóng)作物上，尚鮮見(jiàn)研究復(fù)合重金屬對(duì)藥用植物影響的研究，洋甘菊提煉出的產(chǎn)物是比較流行的保健和藥物制品，具有緩解失眠、發(fā)炎等功效，具有一定經(jīng)濟(jì)效益，研究洋甘菊在重金屬污染下的相關(guān)生理指標(biāo)的變化，探索其是否具有較強(qiáng)的重金屬耐受性，對(duì)于篩選重金屬污染修復(fù)藥用植物具有重要意義，將為藥用植物應(yīng)用于重金屬污染土壤修復(fù)奠定理論研究基礎(chǔ)。

1 研究材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

洋甘菊種子由佳木斯大學(xué)科技園實(shí)驗(yàn)中心提供，重金屬添加方式為硝酸鉛和氯化鎘。

1.2 試驗(yàn)方法

將各濃度梯度的重金屬溶液與土壤充分混合，放置陰涼處處理30～50 d。選取飽滿(mǎn)的洋甘菊種子每盆50粒，均勻播入土壤中，6次重復(fù)，5個(gè)處理(添加復(fù)合重金屬鉛和鎘濃度依次為20-100、40-200、60-300、80-400、100 mg/kg-500 mg/kg)，置于光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，每天適當(dāng)補(bǔ)充水分[1]。第5 d測(cè)定種子的出苗率，60 d后測(cè)定過(guò)氧化物酶活性、脯氨酸含量等生理指標(biāo)。

1.3 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定

取1g洋甘菊的葉片，將葉片剪碎，放置于研缽內(nèi)，取5 mL磷酸緩沖溶液加入，研成勻漿，4000 r/min離心10 min。將離心所得的上清液轉(zhuǎn)入試管內(nèi)保存于冷處，其余沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取一次，量出合并上清液的總體積，備用保存于低溫處。將反應(yīng)混合物取3 mL加入0.1 mL提取酶溶液至比色杯中，對(duì)照用反應(yīng)混合物3 mL加入0.1 mL磷酸緩沖液至比色杯中。立即測(cè)OD470，10 min后重復(fù)測(cè)量，根據(jù)以下公式計(jì)算出相應(yīng)的過(guò)氧化物酶的活性[2]。

過(guò)氧化物酶活性=(ΔD470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(μ/g·min)

式中：W為樣品鮮重；t為反應(yīng)時(shí)間；Vt為總體積；Vs為測(cè)定時(shí)吸取的體積。

1.4 脯氨酸含量的測(cè)定

秤取0.5 g洋甘菊幼苗清洗干凈放入比色管中，加入3%磺基水楊酸5 mL，蓋蓋浸提10 min(經(jīng)常搖動(dòng))于沸水浴中，冷卻后，取干凈的比色管，過(guò)濾，即為洋甘菊脯氨酸的提取液。取2 mL提取液至于比色管內(nèi)加入2 mL冰醋酸、3mL酸性茚三酮，加熱40 min于沸水浴中，溶液呈現(xiàn)紅顏色，以甲苯為對(duì)照，測(cè)OD520，根據(jù)脯氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，查出脯氨酸含量a。由脯氨酸含量計(jì)算公式即得出洋甘菊幼苗脯氨酸的含量[3]。

結(jié)果計(jì)算：

脯氨酸含量 =(a×Vt/Vs)/(W×106)×100%

式中：W為樣品鮮重；a為提取液中的脯氨酸濃度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得；Vt是總體積；Vs為測(cè)定時(shí)吸取體積。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 出苗率

出苗率可以直觀反應(yīng)種子的發(fā)芽情況，不同濃度的鉛和鎘脅迫下洋甘菊種子的萌發(fā)具有一定程度的影響[4]。由圖1可知，洋甘菊出苗率隨復(fù)合重金屬鉛和鎘處理濃度的增加呈現(xiàn)趨勢(shì)為先上升后下降，在復(fù)合重金屬鉛-鎘處理濃度是40 mg/L-200 mg/L時(shí)，洋甘菊出苗率達(dá)到54.43%，為最大值。表明復(fù)合重金屬鉛和鎘對(duì)洋甘菊出苗率表現(xiàn)為低促髙抑的作用，從出苗率反映出其對(duì)重金屬鉛和鎘脅迫的最大耐受濃度為40 mg/L-200 mg/L。

圖1 鉛鎘復(fù)合污染對(duì)洋甘菊出苗率的影響

2.2 鉛和鎘復(fù)合脅迫對(duì)洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶的影響

圖2 鉛鎘復(fù)合污染對(duì)洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶的含量的影響

過(guò)氧化物酶的作用主要是將過(guò)氧化氫水解，過(guò)氧化氫是氫催化酶催化的氧化還原反應(yīng)中的細(xì)胞毒性物質(zhì)，過(guò)氧化物酶體中存在氧化酶和過(guò)氧化氫酶，起保護(hù)細(xì)胞的作用[5]。復(fù)合重金屬鉛和鎘脅迫對(duì)洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶的含量的影響見(jiàn)圖2，可以發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合重金屬濃度增大，過(guò)氧化物酶的含量逐漸增大，與對(duì)照相比，各處理濃度的過(guò)氧化物酶含量均高于對(duì)照，且差異顯著(P<0.05)。

2.3 復(fù)合重金屬鉛和鎘脅迫對(duì)洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影響

植物體內(nèi)的脯氨酸含量在逆境條件下增加顯著，且能在一定范圍內(nèi)反映出植物的抗逆性。因此通過(guò)對(duì)脯氨酸含量的測(cè)定可以用于抗旱育種的生理指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。由圖3可知隨著復(fù)合重金屬濃度的增加，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量逐漸增大，當(dāng)復(fù)合重金屬鉛-鎘濃度高于60mg/kg-300mg/kg時(shí)，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量顯著高于對(duì)照(CK)，分別升高了2.28倍、2.34倍、2.46倍(P<0.05)。說(shuō)明復(fù)合重金屬污染增大洋甘菊幼苗植物組織抗旱能力。

圖3 單因素復(fù)合濃度污染對(duì)洋甘菊幼苗脯氨酸的含量的影響

3 討論

3.1 復(fù)合重金屬鉛和鎘對(duì)洋甘菊出苗率的影響

植物的出苗率能既能反映種子的質(zhì)量和活力 ，也能反映植物對(duì)重金屬脅迫的抗性能力。陳順鈺[7]等人的研究表明Pb和Cd對(duì)種子發(fā)芽率無(wú)顯著的影響(P>0.05)，但對(duì)幼苗的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用(P<0.05)。李雨心[8]研究表明高濃度的重金屬污染容易對(duì)特定植物的發(fā)芽率產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，并隨著脅迫濃度的增加抑制現(xiàn)象明顯。孫博文[9]等人的研究表明單一Pb、Cd處理時(shí)，對(duì)植物的發(fā)芽率、主根長(zhǎng)均出現(xiàn)高濃度抑制。該試驗(yàn)結(jié)果表明低濃度的復(fù)合重金屬脅迫對(duì)洋甘菊種子的出苗率無(wú)顯著影響，高濃度的復(fù)合重金屬脅迫對(duì)洋甘菊種子的出苗率抑制顯著。該結(jié)果與陳順鈺[7]等、李雨心[8]、孫博文[9]等的研究結(jié)果相似。另外從該試驗(yàn)中也可看出，低濃度的復(fù)合重金屬Pb2+、Cd2+對(duì)種子出苗率有輕微的影響，但與CK相比差異不明顯，高濃度的復(fù)合重金屬脅迫具有較大的抑制作用，出現(xiàn)這種情況的原因是由于洋甘菊種子在復(fù)合重金屬Pb2+、Cd2+的脅迫下具有一定的耐受作用，從而在低濃度的復(fù)合重金屬脅迫下并不會(huì)出現(xiàn)明顯的毒害現(xiàn)象，但在高濃度脅迫下，毒害作用過(guò)大，從而使出苗率受到顯著抑制。

3.2 復(fù)合重金屬鉛和鎘對(duì)洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶含量的影響

朱紅霞[10]等人的研究表明隨著鎘脅迫的濃度升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。陳順鈺[7]等人研究表明隨重金屬脅迫時(shí)間延長(zhǎng)POD活性顯著升高。余國(guó)源[11]研究表明重金屬脅迫下傘房決明的生長(zhǎng)受到輕微抑制，POD活性上升。該試驗(yàn)結(jié)果表明在復(fù)合重金屬脅迫下，洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶的含量隨重金屬濃度增高逐漸增加。該試驗(yàn)結(jié)果與朱紅霞等[10]、陳順鈺等[7]和余國(guó)源[11]的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)相同復(fù)合重金屬濃度脅迫下過(guò)氧化物酶含量會(huì)隨時(shí)間的增加而增加，當(dāng)復(fù)合重金屬濃度超過(guò)一定闕值時(shí)，植物將出現(xiàn)毒害甚至死亡的現(xiàn)象。

3.3 復(fù)合重金屬鉛和鎘對(duì)洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸在植物體內(nèi)不僅是理想的調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，還是膜和酶的自由基清除劑，從而在滲透脅迫下對(duì)植物的生長(zhǎng)起一定的保護(hù)作用，在逆境條件下含量增加顯著，且能在一定程度上反映出植物的抗逆性。高秉婷[12]等研究表明，Zn2+脅迫會(huì)對(duì)脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性產(chǎn)生顯著影響。蔡雄偉[13]研究表明鉛脅迫能使狗牙根葉中游離的脯氨酸含量增多。該試驗(yàn)結(jié)果表明在復(fù)合重金屬鉛和鎘脅迫下，洋甘菊幼苗脯氨酸的含量隨濃度升高而增大，與高秉婷[12]、蔡雄偉[13]研究結(jié)果相似。由于植物組織的抗逆性具有一定的闕值，當(dāng)受害程度超出闕值范圍，則植物出現(xiàn)受損、停止生長(zhǎng)甚至死亡的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

多數(shù)生理生化指標(biāo)均與植物抗重金屬污染的能力有關(guān)，采用盆栽試驗(yàn)研究復(fù)合重金屬鉛和鎘脅迫對(duì)洋甘菊幼苗的影響，洋甘菊幼苗過(guò)氧化物酶含量及脯氨酸含量均隨復(fù)合重金屬脅迫濃度的增高而增多，但洋甘菊的出苗率表現(xiàn)為低濃度影響不顯著，高濃度抑制。結(jié)果表明復(fù)合重金屬鉛和鎘脅迫對(duì)洋甘菊種子萌發(fā)產(chǎn)生一定的毒害作用。可能是通過(guò)抑制種子中的淀粉酶、蛋白酶的活性進(jìn)而影響洋甘菊種子的新陳代謝，降低營(yíng)養(yǎng)利用的能力而產(chǎn)生的。本研究為復(fù)合重金屬脅迫對(duì)藥用植物的生理指標(biāo)的影響提供有價(jià)值的理論依據(jù)。