鄭 南 謝 寧 李 全 周妍妍 高麗娟

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其特征為慢性持續(xù)性的血糖濃度增高、糖耐量異常及尿糖結(jié)果陽性，并可伴有脂質(zhì)代謝異常。根據(jù)糖尿病發(fā)病原因的不同，臨床中又以2型糖尿病為主，且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，2型糖尿病發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。近年來大量臨床研究顯示，中醫(yī)藥對于2型糖尿病在控制血糖、改善胰島素抵抗、提高胰島素表達(dá)等方面療效確切，且具有毒副作用小、依賴性小的特點[2]。御唐丸是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)謝寧教授結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗研制而成的純中藥復(fù)方制劑，臨床研究表明其對2型糖尿病療效確切[3]。為進(jìn)一步闡述御唐丸的作用機制，我們觀察御糖丸對糖尿病模型大鼠空腹血清胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠150只，體質(zhì)量180～200 g，周齡8周，采購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(黑)2017-012。

1.2 藥物 御唐丸(主要由黃芪、山茱萸、龜版、烏梅、女貞子、麥冬、山藥、白芍、鹿茸、西洋參、玉竹及葛根組成，由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室負(fù)責(zé)加工制作)；糖尿樂膠囊(河南輔仁堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10983076)；鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H11021518)。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 試劑 大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、TC測定試劑盒、TG測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；胰島素免疫組化檢測試劑盒(上海一研生物科技有限公司)。

1.3.2 儀器 Infinite F50全自動酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；ZY-1280型全自動生化分析儀(上海科華生物工程股份有限公司)；BX60生物顯微鏡(日本Olympus公司)；紫外分光光度計(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；快速血糖儀(德國羅氏公司)；組織包埋機、石蠟切片機(澳大利亞Daintree Scientific公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 將150只SD大鼠隨機分為空白對照組20只及造模組130只?？瞻捉M予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模組予高脂高糖飲食喂養(yǎng)，并采用STZ腹腔注射法建立2型糖尿病模型[6]，連續(xù)喂養(yǎng)10周，以大鼠空腹腹腔注射血糖(FPG)>16.7 mmol/L且維持1周以上表示造模成功。最后共108只造模成功。

1.4.2 分組及給藥 將造模成功的108只大鼠隨機分為御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組、糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組及模型對照組，每組20只，剩余8只大鼠剔除。御唐丸高、低劑量組分別按2.70、1.35 g/(kg·d)予御唐丸藥液灌胃，糖尿樂膠囊組按0.09 g/(kg·d)予糖尿樂膠囊藥液灌胃，鹽酸二甲雙胍組按2.43 g/(kg·d)予鹽酸二甲雙胍片藥液灌胃，空白對照組及模型對照組分別予2 mL/d蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃8周。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 標(biāo)本采集 各組大鼠均在末次給藥后禁食水12 h，然后通過摘除眼球取血的方法獲得全血，室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃冷凍保存。取血完畢后采用脫頸法處死大鼠，解剖并摘取胰腺組織，置于4%的多聚甲醛固定液中固定，備用。

1.5.2 FINS檢測及HOMA-IR計算 各組大鼠取血后首先采用快速血糖儀進(jìn)行FPG檢測，然后均取定量血清，采用ELISA法進(jìn)行FINS檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行測定。得到FPG及FINS數(shù)值后再根據(jù)公式計算HOMA-IR。計算公式：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.5.3 TG及TC檢測 各組均取定量血清，采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行測定。

1.5.4 胰腺組織胰島素表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法對各組大鼠胰腺組織胰島素表達(dá)進(jìn)行檢測。主要步驟：用石蠟包埋胰腺組織并切片，60 ℃恒溫烤箱中至少烤片1 h，放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇水化，每次2 min；按照一抗的需要，采用抗原修復(fù)液對組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)處置，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；封閉緩沖液封閉，37 ℃孵育30 min，滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次；封閉緩沖液封閉，37 ℃孵育10 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-SA)(濃度1∶50～200)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次；使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封固劑封片。最后在顯微鏡下觀察，并采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)[麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]進(jìn)行分析，棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，淡藍(lán)色背景為陰性表達(dá)，陽性目標(biāo)面積占統(tǒng)計場面積的百分比就是陽性目標(biāo)面密度，記錄數(shù)值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠入組情況 實驗過程中，各組部分大鼠由于高血糖水平、STZ毒性及灌胃不當(dāng)?shù)仍虺霈F(xiàn)死亡，灌胃8周后共計死亡29只，最終每組各選取順利完成實驗的8只大鼠進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.2 各組大鼠灌胃后血清FINS及HOMA-IR水平比較 見表1。

組 別nFINS(mmol/L)HOMA-IR空白對照組88.83±1.261.71±0.16模型對照組838.08±2.01?41.02±4.75?糖尿樂膠囊組833.89±2.21△26.46±2.92△鹽酸二甲雙胍組837.82±2.69△20.86±1.98△御唐丸低劑量組834.57±4.93△23.08±3.02△#御唐丸高劑量組829.54±1.82△#□◇21.23±2.72△#

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表1可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯下降(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯降低(P<0.05)，御唐丸低劑量組灌胃后HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05)，HOMA-IR水平與其相當(dāng)(P>0.05)，御唐丸低劑量組FINS及HOMA-IR水平與其比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05)，HOMA-IR水平與其相當(dāng)(P>0.05)。

2.3 各組大鼠灌胃后血清TC及TG水平比較 見表2。

組 別nTCTG空白對照組81.21±0.090.38±0.05模型對照組82.81±0.60?1.44±0.51?糖尿樂膠囊組82.27±0.31△1.14±0.22△鹽酸二甲雙胍組81.57±0.28△0.65±0.15△御唐丸低劑量組82.26±0.28△□0.85±0.14△#御唐丸高劑量組81.68±0.17△#◇0.67±0.15△#

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表2可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后TC及TG水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05)，御唐丸低劑量組灌胃后僅TG水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平與鹽酸二甲雙胍組相當(dāng)(P>0.05)，御唐丸低劑量組TC水平則明顯高于鹽酸二甲雙胍組(P<0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后TC水平明顯低于御唐丸低劑量組(P<0.05)，TG水平與其相當(dāng)(P>0.05)。

2.4 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)情況比較 見表3。

組 別n胰腺組織胰島素空白對照組56.260±1.104模型對照組50.570±0.123?糖尿樂膠囊組50.875±0.179鹽酸二甲雙胍組52.224±0.535△御唐丸低劑量組51.589±0.402△御唐丸高劑量組53.003±0.845△#◇

與空白對照組比較,*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05；與御唐丸低劑量組比較，◇P<0.05

由表3可見，與空白對照組比較，模型對照組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型對照組比較，鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，糖尿樂膠囊組表達(dá)雖也有升高趨勢，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與糖尿樂膠囊組比較，御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)明顯升高(P<0.05)，御唐丸低劑量組表達(dá)雖也有升高，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較，御唐丸高、低劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)水平與其比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較，御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

2.5 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素免疫組化觀察情況 空白對照組：胰島細(xì)胞邊界清晰，染色顆粒分布濃密均勻。模型對照組：胰島細(xì)胞被破壞，染色顆粒分布密度不均。糖尿樂膠囊組:胰島細(xì)胞邊界模糊，分布紊亂，染色顆粒微見。鹽酸二甲雙胍組：胰島細(xì)胞邊界清晰，染色顆粒分布較少。御唐丸低劑量組:胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整，染色顆粒相對明顯。御唐丸高劑量組:胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，染色顆粒明顯。見封3，圖1。

3 討 論

2型糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，與糖尿病家族史、不良飲食習(xí)慣、體力活動少、肥胖、酗酒等因素密切相關(guān)，同時由于長期高血糖的影響，可導(dǎo)致碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，大血管、微血管受損，造成多器官的慢性損傷和功能障礙，而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥[4-5]。2型糖尿病為進(jìn)展性的疾病，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是其發(fā)病的主要原因，但在其發(fā)生和發(fā)展過程中，究竟是胰島素抵抗先出現(xiàn)，還是胰島素分泌量不足先出現(xiàn)，尚存在一定爭議[6-7]。胰島素抵抗是指一定濃度胰島素對葡萄糖代謝所產(chǎn)生的生物反應(yīng)偏低、生物學(xué)效應(yīng)減弱的現(xiàn)象。胰島β細(xì)胞合成并分泌胰島素主要由血糖濃度的高低決定，但當(dāng)機體出現(xiàn)胰島素抵抗時，胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，正常水平的胰島素?zé)o法激發(fā)誘導(dǎo)肌肉和脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的信號,血糖濃度不斷升高，又會對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用，進(jìn)而促使胰腺代償性合成分泌更大量的胰島素，產(chǎn)生高胰島素血癥以維持血糖的穩(wěn)定，而一旦胰島β細(xì)胞受到破壞，在高血糖的情況下無力表達(dá)和分泌更多的胰島素，則說明患者正從單純的胰島素抵抗向2型糖尿病轉(zhuǎn)變[8-9]。脂質(zhì)代謝紊亂也是2型糖尿病最常見的臨床表現(xiàn)之一，胰島素抵抗或胰島素含量不足均可減弱機體對釋放游離脂肪酸(NEFA)的抑制作用，脂肪組織發(fā)生快速分解，導(dǎo)致大量NEFA被釋放，NEFA通過門靜脈循環(huán)入肝，促進(jìn)肝臟分泌大量的TC、TG，導(dǎo)致TC、TG水平明顯升高[10]。另外，脂蛋白酯酶是水解TG的關(guān)鍵酶，其活性不僅取決于基因的表達(dá)，還與胰島素的作用密切相關(guān)。2型糖尿病患者由于胰島素水平不足或胰島素抵抗，導(dǎo)致胰島素作用減弱，脂蛋白酯酶活性降低，進(jìn)而出現(xiàn)TG水平升高[11]。本實驗結(jié)果也顯示，模型對照組FINS、HOMA-IR、TC及TG水平較空白對照組均明顯升高(P<0.05)，且胰腺組織中胰島素表達(dá)明顯降低(P<0.05)。糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片都是臨床上治療2型糖尿病的常用藥，對2型糖尿病均有確切療效[12-13]，因此我們選為陽性藥物進(jìn)行對照觀察。本實驗結(jié)果也顯示，糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片對糖尿病模型大鼠血清FINS、HOMA-IR、TC、TG均有不同程度的改善。

2型糖尿病屬中醫(yī)學(xué)消渴范疇，《內(nèi)經(jīng)》中有消渴、消癉、肺消、晶消、消中等10余種病名[14]?！端貑枴て娌≌摗吩唬骸按宋鍤庵缫玻黄D。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也……肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。”雖然歷代中醫(yī)學(xué)者對2型糖尿病的病因、病機認(rèn)識各不相同，治療方法也各有側(cè)重，但均以健脾補腎為重，認(rèn)為消渴是以陰虛為本，燥熱為標(biāo)，真陰虧竭于下，相火妄動于上，水火失濟(jì)所致。脾為后天之本，主升清，運化水谷精微，濡養(yǎng)五臟六腑，若氣機升降失常，脾所化生之精微不得上達(dá)反而直趨下行，終致陰精自小便而出。腎藏先天之本，主納氣，腎陽充足則氣化、蒸騰作用如常，腎陽不足，津液代謝異常，津液向上輸布無力則口渴欲飲，膀胱失于氣化則小便量多頻數(shù)。御唐丸正是謝寧教授以健脾補腎、益氣養(yǎng)陰為法治療2型糖尿病的經(jīng)驗方。方中黃芪、西洋參健脾益氣，滋陰補腎，養(yǎng)陰生津；玉竹養(yǎng)陰潤燥，生津止渴；麥冬重滋肺胃，與西洋參合用又走腎水，金水肺腎相濟(jì)，止渴生津潤燥；山茱萸補肝益腎，收斂固澀；山藥補中益氣，消渴生津，山藥重補脾之陰精，黃芪重補脾之陽氣，兩藥共用，化漏濁，益脾精，助脾胃運化；葛根升陽止瀉，生津止渴；鹿茸補腎壯陽，補精益髓；烏梅收斂生津，清熱除煩；龜版滋陰潛陽,補腎健骨；女貞子補腎填精；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗?？v觀全方，配伍精當(dāng)，共奏健脾補腎、益氣養(yǎng)陰之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪主要含有氨基酸類、微量元素、黃酮類、皂甙、多糖等成分，能夠減少胰島β細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)胰島β細(xì)胞合成并分泌胰島素[15]；西洋參的主要活性成分是人參總皂苷，能夠促進(jìn)胰島組織合成并分泌胰島素，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，提高機體攝取和消耗葡萄糖的能力，對糖、脂代謝通路產(chǎn)生影響，減少腸道對脂肪及葡萄糖的吸收[16]；女貞子中的齊墩果酸對糖尿病大鼠具有良好的降血糖、降血脂效果，并且齊墩果酸還具有抗自由基損傷的作用,可增強機體的抗氧化能力[17]；玉竹多糖對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖有顯著的抑制作用,可增加機體對葡萄糖的攝取，促進(jìn)肌糖原合成[18]。本實驗結(jié)果也顯示，御唐丸高、低劑量組干預(yù)后，血清FINS、HOMA-IR、TC、TG水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況較模型對照組均有明顯改善(P<0.05)，且御唐丸高劑量組FINS、TC水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況改善優(yōu)于御唐丸低劑量組(P<0.05)，且其治療效果優(yōu)于糖尿樂膠囊，基本與鹽酸二甲雙胍片相當(dāng)，并在降低FINS水平方面優(yōu)于鹽酸二甲雙胍片(P<0.05)。

綜上所述，御唐丸對糖尿病大鼠具有確切療效，可明顯降低大鼠血清FINS水平，，提高胰腺組織的胰島素的表達(dá)，減輕胰島素抵抗情況，降低TC及TG水平，改善脂質(zhì)代謝，且具有一定的量效關(guān)系，高劑量水平可能效果更佳。