姜 巖，張 陸，高軍勝，張 沖，劉 杰

鄭州人民醫(yī)院骨科，鄭州 450000

椎間盤退行性變是導(dǎo)致下腰痛的主要原因之一［1］，超過(guò)80%的人在其一生中會(huì)經(jīng)歷一次或多次下腰痛或肩頸痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量［2］。椎間盤由外圍的纖維環(huán)、中心的髓核和上下終板構(gòu)成，已有研究證明，椎間盤髓核細(xì)胞的異常凋亡是引起髓核細(xì)胞數(shù)量減少的關(guān)鍵因素，從而引起椎間盤退行性變［3］。Fas 相關(guān)死亡功能域蛋白（FADD）是Fas/FasL系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的胞漿死亡信號(hào)蛋白，它可以調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［4］。

微RNA（miRNA）是一類由19 ~ 25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，通過(guò)降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)椎間盤退行性變的生理病理過(guò)程［5］。miRNA-129-5p（miR-129-5p）是近年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制miRNA［6-8］，陳宇飛［9］的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生退行性變的椎間盤髓核組織中miR-129-5p 表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)對(duì)椎間盤有保護(hù)作用，且miR-129-5p 可以靶向作用Ⅰ型膠原基因和整合素α1 基因而影響細(xì)胞生物學(xué)功能。但miR-129-5p 在髓核細(xì)胞中是否影響細(xì)胞的凋亡及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究miR-129-5p 是否通過(guò)調(diào)控FADD 影響人椎間盤髓核細(xì)胞（hNPC）凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

hNPC 購(gòu)自美國(guó)ScienCell 公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Coulter公司；聚偏二氟乙烯膜、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、miR 陰性對(duì)照物（miR-NC）、miR-219-5p 模擬子（miR-219-5p mimics）、抑制子陰性對(duì)照物（inhibitor NC）、miR-219-5p 抑 制 子（miR-219-5p inhibitor）、FADD 小 干擾RNA（FADD siRNA）和小干擾RNA 陰性對(duì)照物（siRNA NC）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pcDNA-FADD過(guò)表達(dá)載體由南京金瑞斯生物科技公司構(gòu)建；兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax 多克隆抗體、兔抗人Cleaved Caspase-3多克隆抗體、兔抗人FADD 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group 公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博海生物工程有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將hNPC 培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁約80%時(shí)加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

收集融合度約40%的hNPC，加入胰蛋白酶消化并重懸，以1×105個(gè)/孔的密度接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明將miR-NC、miR-219-5p mimics、inhibitor NC、miR-219-5p inhibitor、pcDNA、pcDNA-FADD、miR-219-5p inhibitor+siRNA NC、miR-219-5p inhibitor+FADD siRNA 分別轉(zhuǎn)染至hNPC，標(biāo)記為miR-con 組、miR組、anti-miR-con組、anti-miR組、pcDNA組、pcDNAFADD 組、anti-miR-siRNA-con 組、anti-miR-siRNA組；以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照，記為Blank 組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)miR-219-5p的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞充分研磨，TRIzol 法提取總RNA，檢測(cè)RNA 純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒（日本TaKaRa 公司）使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，采用2-△△Ct法 分 析 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果。miR-219-5p 正 向 引 物為5′-GGGTCTTAACGCAAACCT-3′，反 向 引 物 為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；β-actin 正 向 引 物為5′-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，反向引物為5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡蛋白和FADD的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h 的細(xì)胞，超聲粉碎，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于冰上裂解5 min，4℃、12 000×g（1 g=9.806 65 m/s2）離 心15 min，收 集上清。將蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉封閉2 h。加入稀釋過(guò)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，ECL試劑盒發(fā)光顯影。將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的光密度，以目的條帶和β-actin 條帶光密度的比值作為蛋白表達(dá)水平。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

Targetscan 在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FADD 3′-UTR 上存在miR-219-5p 的結(jié)合位點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證FADD 是否為miR-219-5p 的靶基因，按照Lipofectamine 2000 使用說(shuō)明書，將構(gòu)建好的野生型FADD 3′-UTR-WT（含F(xiàn)ADD 3′-UTR 片 段）和 突 變 型FADD 3′-UTR-MUT（FADD 3′-UTR 片段突變體）載體分別與miR-219-5p mimic 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后檢測(cè)熒光素酶活性，以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示（相對(duì)熒光強(qiáng)度=螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抑制miR-129-5p表達(dá)對(duì)hNPC凋亡的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，anti-miR 組hNPC 中miR-129-5p 的 表 達(dá) 量 與anti-miR-con 組 相比明顯降低（P < 0.05，圖1），表明miR-129-5p 的表達(dá)被成功抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與antimiR-con 組相比，anti-miR 組hNPC 的凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖2）。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，與anti-miR-con 組相比，anti-miR 組hNPC 中促凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3 表達(dá)上調(diào)（P < 0.05），抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)下調(diào)（P < 0.05），Bax 蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化（圖3），結(jié)果表明抑制miR-129-5p表達(dá)能明顯促進(jìn)hNPC 凋亡。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)hNPC 中miR-129-5p的表達(dá)Fig. 1 miR-129-5p expression in hNPCs detected by real-time quantitative PCR

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制miR-129-5p表達(dá)后hNPC 的凋亡率Fig. 2 Apoptosis rate of hNPCs after inhibiting miR-129-5p detected by flow cytometry

圖3 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)hNPC 中凋亡蛋白的表達(dá)Fig. 3 Expression of apoptotic protein in hNPCs detected by Western blotting

2.2 miR-129-5p靶向FADD影響hNPC凋亡

通過(guò)Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD 3′-UTR上存在miR-129-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖4a）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，將miR-129-5p mimics與FADD 3′-UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性下降（P < 0.05），與FADD 3′-UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P > 0.05，圖4b）；蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，與anti-miR-con 組相比，miR組hNPC 的FADD 表 達(dá) 下 調(diào)（P < 0.05），anti-miR 組hNPC 的FADD表達(dá)上調(diào)（P < 0.05，圖4c）。

圖4 miR-129-5p靶向FADD 的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 Predicting and validation results of miR-129-5p targeting FADDa：FADD 3′-UTR與miR-129-5p 的結(jié)合位點(diǎn) b：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) c：蛋白質(zhì)印跡分析a：Binding site of FADD 3′-UTR and mir-129-5p b：Dual-luciferase reporter gene assay c：Western blotting

轉(zhuǎn) 染pcDNA-FADD 至hNPC 后，pcDNA-FADD組hNPC 的FADD 表達(dá)量與pcDNA 組相比明顯增加（P < 0.05，圖5a），細(xì)胞凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖5b），表明過(guò)表達(dá)FADD 可誘導(dǎo)hNPC 凋亡。抑制miR-129-5p 表達(dá)后，anti-miR 組hNPC 的FADD 表達(dá)量與anti-miR-con 組相比明顯增加（P < 0.05，圖6a），細(xì)胞凋亡率明顯升高（P < 0.05，圖6b）；同時(shí)抑制miR-129-5p 和FADD 表達(dá)后，anti-miR-siRNA組的FADD 表達(dá)量與anti-miR-siRNA-con 組相比明顯降低（P < 0.05，圖6a），細(xì)胞凋亡率也明顯降低（P < 0.05，圖6b），表明miR-129-5p 抑制后FADD 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)hNPC 凋亡。

圖5 過(guò)表達(dá)FADD 誘導(dǎo)hNPC凋亡Fig. 5 hNPC apoptosis induced by over-expression of FADD a：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FADD表達(dá) b：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hNPC 凋亡a：Detection of FADD expression by Western blotting b：Detection of hNPC apoptosis by flow cytometry

圖6 抑制miR-129-5p和FADD 對(duì)hNPC 凋亡的影響Fig. 6 Effect of inhibiting miR-129-5p and FADD on hNPC apoptosisa：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FADD表達(dá) b：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hNPC 凋亡a：Detection of FADD expression by Western blotting b：Detection of hNPC apoptosis by flow cytometry

3 討 論

椎間盤退行性疾病引起的慢性腰腿痛、頸肩痛嚴(yán)重影響人們的正常生活［10］，目前臨床上有多種針對(duì)椎間盤退行性疾病的治療手段，包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療［11］。椎間盤退行性變是自然老化、退化的生理病理過(guò)程，受多種因素影響，是一系列脊柱退行性疾病的前提和病理基礎(chǔ)［12-13］。椎間盤組織再生能力有限，發(fā)生退行性變后較難逆轉(zhuǎn)［14］，患者癥狀存在反復(fù)發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。因此，探索椎間盤退行性變的分子機(jī)制對(duì)發(fā)掘新型治療手段具有重要意義。

細(xì)胞凋亡所造成的椎間盤細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞外基質(zhì)合成減少和成分改變是導(dǎo)致椎間盤退行性變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］。在發(fā)生退行性變的椎間盤中可以觀察到髓核細(xì)胞的凋亡速率明顯加快［16］。細(xì)胞凋亡的過(guò)程中有多種蛋白參與，如Caspase 系列蛋白、Bcl-2 蛋白和p53 蛋白等［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNAGAS5 過(guò)表達(dá)后Caspase-3 表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，髓核細(xì)胞的凋亡率升高［19］。FADD 基因在組織中表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，F(xiàn)ADD 過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。FADD 在發(fā)生退行性變的hNPC 中高表達(dá)，miR-155 通過(guò)調(diào)控FADD和Caspase-3抑制hNPC凋亡［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA-FADD 至hNPC 后，F(xiàn)ADD 表達(dá)量明顯增加，hNPC 的凋亡率也明顯增加，表明FADD 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)hNPC 凋亡。

多種miRNA 可通過(guò)作用于細(xì)胞凋亡影響椎間盤退行性變的發(fā)生和發(fā)展。Liu 等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)染miR-125a 后，髓核細(xì)胞凋亡減少，同時(shí)Caspase-3、Bax 的蛋白表達(dá)量下降，Bcl-2 表達(dá)上調(diào)。Zhang 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生退行性變的椎間盤組織中miR-210 表達(dá)降低，導(dǎo)致HOXA9 蛋白表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)Fas 通路介導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。Zhao等［24］的研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 的甲基化通過(guò)靶向Beclin-1 在椎間盤退行性變中阻斷髓核細(xì)胞自噬。陳宇飛［9］的研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 在發(fā)生退行性變的椎間盤髓核組織中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-129-5p 可以抑制人椎間盤髓核細(xì)胞發(fā)生退行性變，對(duì)椎間盤起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在hNPC 中下調(diào)miR-219-5p 的表達(dá)，hNPC 的凋亡率明顯升高，促凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)量明顯升高，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯下降。通過(guò)Targetscan 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-219-5p 與FADD 有結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-219-5p與FADD之間存在靶向關(guān)系。在hNPC 中，上調(diào)miR-219-5p 可抑制FADD 的表達(dá)，下調(diào)miR-219-5p 可促進(jìn)FADD 的表達(dá)。將miR-219-5p inhibitor 和FADD siRNA 共 轉(zhuǎn) 染 至hNPC 后 發(fā) 現(xiàn)與hNPC 凋亡率降低，表明抑制FADD 可逆轉(zhuǎn)miR-219-5p低表達(dá)對(duì)hNPC凋亡的促進(jìn)作用，進(jìn)一步說(shuō)明miR-219-5p低表達(dá)通過(guò)上調(diào)FADD促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，抑制miR-219-5p 的表達(dá)可促進(jìn)hNPC 中FADD 表達(dá)，hNPC 凋亡率也隨之升高，表明miR-219-5p 可靶向作用FADD 調(diào)控hNPC 的凋亡，這為椎間盤退行性變的分子治療提供了新靶點(diǎn)。