楊小琴，王 洋，齊曉寧，孫露瑩，張夢杰，宋鳳斌，劉勝群，李向楠，朱先燦

(1．中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長春 130102；2．中國科學院大學，北京 100049)

0 引 言

間作通常指在同一塊土地上種植兩種及兩種以上作物的種植模式，當一種作物生長到一定階段，在其行間種植其它作物(一種或多種)被稱為套種[1]。間套作的合理布局有利于高效利用光照、熱量、水分及養(yǎng)分等資源[2]，增加作物產(chǎn)量[3]，提高土地當量比[4]。中國耕地面積僅占世界7%，卻養(yǎng)活了世界人口的22%[5]，多熟制種植下的間套作模式起著重要作用[6]。

玉米，世界三大糧食作物之一，是優(yōu)質(zhì)的飼料和工業(yè)原料[7]。世界玉米總產(chǎn)量的21.9%由我國貢獻[8]，而吉林省玉米產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的1/8[9]。長期以來，吉林省玉米種植以單作為主，土地利用效率不高，且黑土肥力逐漸下降[10]。平菇(Pleurotusostreatus)，隸屬于真菌界擔子菌門，因其味道鮮美、營養(yǎng)成分含量高，逐漸成為一種重要的食用菌[11]。在蔭蔽濕潤環(huán)境條件下，平菇生長旺盛，會產(chǎn)生大量菌絲體和非特異性的木質(zhì)纖維素酶[12]，因而常作為間作作物以促進養(yǎng)分等資源的有效利用[13]。蠶豆間作蘑菇研究顯示，與單作相比，蠶豆間作牡蠣蘑菇增加了蠶豆干種子產(chǎn)量和牡蠣蘑菇擔子菌產(chǎn)量[14]。已有研究表明，玉米間作大豆[15]、花生[16[、苜蓿[17]及小麥[18]等系統(tǒng)中，田間作物高矮相間，光照條件有效改善，玉米功能葉的光合速率提高，間作處理下玉米產(chǎn)量均明顯高于單作。

從20世紀90年代起，玉米間作平菇的生產(chǎn)實踐和試驗研究順利開展，間作條件下玉米和平菇畝產(chǎn)提高，經(jīng)濟效益良好[19]。但玉米平菇間作種植模式的研究大多偏重技術(shù)，基礎(chǔ)研究不足，在玉米高光效種植模式下，對玉米平菇間作共生期內(nèi)玉米穗位葉的光合作用及關(guān)鍵酶活性的研究較為缺乏。

玉米物質(zhì)生產(chǎn)的基礎(chǔ)很大程度來源于葉片的光合作用，在玉米生長中后期，穗位葉光合指標高低、干物質(zhì)積累速率與分配情況對產(chǎn)量有重要影響[20]。另外，穗位葉光合作用強弱與其關(guān)鍵酶的活性密切相關(guān)[21]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4植物光合碳同化途徑的第一個關(guān)鍵酶[22]；蘋果酸脫氫酶(MDH)可以催化蘋果酸與草酰乙酸間的可逆轉(zhuǎn)化，而蘋果酸酶(NADP-ME)主要功能是催化蘋果酸氧化脫羧生成CO2和丙酮酸，之后CO2進入卡爾文循環(huán)[23]；核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)通過對碳固定以及光呼吸碳氧化的控制，對植物光合速率具有重要影響[24-25]；同時，丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)作為C4循環(huán)中CO2固定的主要限速酶，催ATP及丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，為C4植物光合作用提供重要碳源[26]。

玉米高光效種植模式主要根據(jù)玉米株高、經(jīng)緯度、北半球夏季太陽高度角及方位角，確定了吉林省中部地區(qū)玉米最佳種植壟距為160 cm+40 cm的組合壟(2行玉米播種在40 cm的窄行上，160 cm寬行為休閑行)，壟向為磁南偏西20°，改善了光照在玉米群體內(nèi)的分布，提高了壟間的通風透光能力[27]，同時采用留高茬秸稈全株還田與休耕輪作，促進了有機質(zhì)積累和耕地的可持續(xù)利用[28]。

本研究在玉米高光效種植模式的寬行(160 cm)間作平菇，以單作玉米為對照，主要探討共生期內(nèi)間作對群體微氣象環(huán)境、玉米穗位葉光合作用及關(guān)鍵酶活性的影響，這有助于提高米菇間作體系下玉米葉片光合碳同化方面的認識，并為米菇間作生產(chǎn)實踐提供一些理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

試驗在長春綜合農(nóng)業(yè)試驗站(125°24′E，43°54′N)連續(xù)開展2年(2017年、2018年)，試驗區(qū)土壤類型為典型薄層黑土，氣候類型為中溫帶大陸性氣候，年平均降雨量530.5 mm，年平均氣溫4.6 ℃，無霜期較短(138 d)。土壤的物理和化學性質(zhì)如表1。

表1 試驗地土壤理化性質(zhì)

供試玉米和平菇分別為良玉99和紫孢側(cè)耳。試驗共設(shè)置3個處理(如圖1)，分別為：玉米平菇間作(CM)、單作玉米(C)和單作平菇(M)處理，重復3次，共9個小區(qū)(面積為20 m×8 m=160 m2)，種植行向為磁南偏西20°。玉米平菇間作和單作玉米均采用高光效種植模式，即160 cm+40 cm組合壟，窄行(40 cm)上種植玉米，株距和種植密度分別為15 cm、6.5×104hm-2；玉米平菇間作處理布設(shè)方式如下：首先，在寬行(160 cm)內(nèi)挖一條寬約40 cm、深約12 cm的畦溝(與玉米間距為27 cm)；再者，將菌棒均勻地排布于畦溝內(nèi)，并在其表面覆蓋3 cm土；單作平菇處理的行距為160 cm，與間作相同，且平菇生長期內(nèi)，采用間斷性噴灌以保持土壤濕潤。基施600 kg·hm-2的控釋復合肥(總養(yǎng)分≥53%)。2017年，玉米播種和收獲日期分別為4月26日、9月30日；在玉米抽穗期(7月12日)種植平菇，一茬菇、二茬菇收獲日期分別為8月5日、9月3日。2018年，玉米播種和收獲日期分別為4月27日、9月28日；7月11日種植平菇，一茬菇、二茬菇收獲日期分別為7月21日、8月11日。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 環(huán)境參數(shù)。在田間安置環(huán)境記錄儀(邯鄲市邯山瑞華電子有限公司)監(jiān)測空氣溫濕度、CO2以及土壤溫度。其中測定空氣溫濕度、CO2濃度探測器置于冠層內(nèi)部(距離地面20 cm)，土壤濕度探測器置于土壤內(nèi)部(埋藏深度15 cm)。

1.2.2 光合熒光參數(shù)測定。2018年，在平菇種植10 d(一茬菇：7月21日)、20 d(無菇期：8月1日)和30 d(二茬菇：8月11日)后。用LI-6400型光合儀(美國LI-COR公司)測定玉米穗位葉的光合參數(shù)，光強設(shè)定為2 000 μmol·m-2·s-1的，重復4次。

平菇種植10 d(一茬菇)后，用的MultispeQ(美國PhotosynQ公司)測定玉米穗位葉的熒光參數(shù)。

1.2.3 樣品采集及測定。2018年7月21日(一茬菇)、8月2日(無菇期)和8月11日(二茬菇)采集玉米穗位葉(中部)樣品，并避開主葉脈，4次重復。將樣品放入液氮罐冷凍，采樣結(jié)束后，置于實驗室-80 ℃冰箱保存。干樣采集方法：用剪刀取玉米棒三葉(穗位葉及其上、下兩葉)，4次重復，放入干凈的檔案袋中保存，烘箱內(nèi)105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干，粉碎后測定可溶性糖和淀粉。

5種關(guān)鍵酶(PPDK、Rubisco、NADP-ME、MDH和PEPC)活性測定方法：取適量鮮樣放入研缽，添加少許液氮后充分研磨，取0.1 g樣品置于2 mL離心管內(nèi)，添加0.9 mL磷酸緩沖鹽溶液(0.01M pH 7.4)，用混勻器將樣品和溶液混合均勻，4 ℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 rpm，取上清液待用。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒(江蘇酶標有限責任公司)測定5種關(guān)鍵酶活性。

考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[29]：其原理為蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合后顏色由紅轉(zhuǎn)藍，會導致最大光吸收從460 nm變?yōu)?95 nm，用分光光度計測定595 nm光吸收的增加量，最終可計算出可溶性蛋白質(zhì)含量。

蒽酮法測定可溶性糖含量[29]：在濃硫酸作用下，經(jīng)過脫水反應的糖類會產(chǎn)生藍綠色的糠醛衍生物，其顏色深淺與糖含量成正比例關(guān)系。加入蒽酮試劑后，糖類與其反應生成的有色物質(zhì)，用分光光度計可測定620 nm的吸收峰，計算后得到可溶性糖含量。

硫酸-苯酚法測定淀粉含量：在硫酸的作用下，多糖會水解成單糖后迅速脫水產(chǎn)生糖醛衍生物；加入苯酚試劑后，與其生成橙黃色化合物，用比色法測定后計算得出樣品中的淀粉含量。具體操作：由于水解液(1 mL)樣品濃度過高，加蒸餾水稀釋100倍，取稀釋后2 mL樣液，加入1 mL苯酚(6%)溶液和5 mL濃硫酸，用混勻器將樣品和溶液混合均勻后，放置20 min，測定490 nm的吸光度計算得到總還原糖量含量，該值乘以0.9即為淀粉含量。

1.2.4 收獲測產(chǎn)。于2017-2018年玉米成熟期，取兩處理具有代表性的20 m2果穗，測量其穗重，并取20個果穗標準樣本，風干后測定出籽率和含水率，最終計算玉米產(chǎn)量。

1.2.5 土地當量比。應用土地當量比(LER)作為衡量間作產(chǎn)量優(yōu)勢的指標[30]。

LER=(Yip/Yp)+(Yim/Ym)

式中：Yip和Yim分別代表間作總面積上平菇和玉米的產(chǎn)量；Yp和Ym分別為單作平菇和單作玉米的產(chǎn)量。當LER>1為間作優(yōu)勢，當LER<1為間作劣勢。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖

用Microsoft Excel 2007和SPSS 23進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米平菇間作對微環(huán)境參數(shù)的影響

溫濕度和CO2濃度(外部環(huán)境條件)會影響玉米光合作用，其自身也受種植方式的影響。圖2顯示，玉米平菇間作共生期內(nèi)(7月11日-8月23日)，間作處理下空氣濕度和CO2濃度為86.9%、504.8 ppm，顯著高于單作玉米(26.8%、394.8 ppm)(P<0.01)。間作處理下空氣溫度和土壤溫度為24.7 ℃、22.9 ℃，與單作玉米(24.0 ℃、23.2 ℃)相比無顯著差異；無菇期(8月2日)，間作的空氣濕度和CO2濃度出現(xiàn)下降趨勢，與單作玉米環(huán)境參數(shù)差異明顯減小。

2.2 玉米平菇間作對玉米穗位葉的光合特性

單作與間作玉米穗位葉的凈光合速率(PN)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)，隨著時間有先上升后下降的趨勢(圖3)。間作玉米穗位葉PN在一茬菇(7月21日)和二茬菇(8月11日)分別為43.6 μmol CO2·m-2·s-1、38.8 μmol CO2·m-2·s-1，比單作高15.6%和25.7%，且在二茬菇差異達到顯著(P<0.05)，無菇期(8月1日)間作與單作玉米的PN無顯著差異。一茬菇(7月21日)和二茬菇(8月11日)期間，間作玉米穗位葉的Gs分別為0.3 mol H2O·m-2·s-1、 0.2 mol H2O·m-2·s-1，均比單作高0.2 mol H2O·m-2·s-1；而在無菇期(8月1日)則顯著低于單作玉米(P<0.05)，Tr與Gs的變化趨勢相同。

單作與間作玉米穗位葉的Ci無顯著差異，無菇期(8月1日)間作的Ci為194 μmol CO2·m-2·s-1，低于單作玉米(232 μmol CO2·m-2·s-1)，但一茬菇(7月21日)、二茬菇(8月11日)均高于單作玉米(P>0.05)。結(jié)果顯示，間作處理下盛菇期提高了玉米穗位葉的PN，這將有助于玉米光合碳同化效率的提升。

2.3 間作玉米穗位葉的葉綠素熒光動力學參數(shù)

光合作用的機理可以通過葉綠素熒光參數(shù)來反映[31]，葉綠素熒光技術(shù)是研究PSII功能和反應的有效手段[32-33]。最大光化學效率(Fv/Fm)和實際光化學效率(Y(Ⅱ))，分別指示植物的潛在最大光合能力(光合效率)和實際光合能力；PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(Y(NPQ))和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(Y(NQ))分別為光保護和光損傷的重要指標；如果 Y(NPQ)較高，則表示植物吸收了過剩的光能，但植物可以通過適當?shù)恼{(diào)節(jié)(如熱耗散)來保護自身；如果Y(NQ)較高，則表示保護性調(diào)節(jié)機制不能將植物接受的過剩光能完全消耗掉。

研究表明，一茬菇(7月21日)，米菇間作模式下的玉米穗位葉Fv/Fm顯著高于單作玉米(表2，P<0.05)；間作玉米的Y(II)和Y(NQ)高于單作玉米，均未達到顯著水平；而間作處理的Y(NPQ)顯著低于單作玉米(P<0.05)。由此推測，米菇間作期(一茬菇)玉米穗位葉最大光合速率和實際光合速率的提高與光能傳遞、轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

表2 間作對玉米熒光參數(shù)的影響

注：不同小寫字母表示處理間在P<0.05水平上差異顯著。

Note:Different samll letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.

2.4 間作玉米穗位葉的光合作用5種關(guān)鍵酶活性

間作對玉米光合作用5種關(guān)鍵酶的影響見圖4，與單作玉米相比，玉米平菇間作一茬菇(7/21)時期，5種關(guān)鍵酶的活性差異均不顯著；無菇期(8/2)，除Rubisco酶活性稍高外，MDH、NADP-ME、PEPC、PPDK酶活性均低于單作玉米，但都未達到顯著水平；而二茬菇(8月11日)間作提高了玉米穗位葉的MDH、NADP-ME、PEPC、PPDK、Rubisco酶活性，其中MDH酶活性顯著高于單作玉米(P<0.01)，是單作玉米的2.4倍，PEPC酶活性是單作玉米的1.7倍。

檢驗結(jié)果表明，生育時期對玉米的MDH(P<0.01)、NADP-ME(P<0.01)、Rubisco酶活性(P<0.01)有極顯著影響(表3)，種植模式對玉米5種光合作用關(guān)鍵酶的影響均不顯著；但是，時期與種植方式的交互作用對MDH酶活性有極顯著影響(P<0.01)。這表明，玉米間作平菇二茬菇時期提高了碳素同化的關(guān)鍵酶活性，為玉米生長中后期(灌漿成熟期)光合產(chǎn)物的積累奠定了基礎(chǔ)。

2.5 間作玉米穗位葉的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉

可溶性蛋白質(zhì)(包含多種酶源、酶分子以及代謝調(diào)節(jié)物)，在植物的蛋白質(zhì)組分中扮演著最活躍的角色。間作處理下玉米棒三葉的可溶性蛋白質(zhì)含量高于單作，在二茬菇(8月11日)期較為明顯(圖5，P>0.05)；另外，生育時期對可溶性蛋白含量的影響顯著(P<0.01)。與單作玉米相比，間作處理玉米棒三葉的可溶性糖及淀粉含量稍低(一茬菇和無菇期)，但二茬菇稍高(P>0.05)。由此推測，玉米生育種中后期(二茬菇)，間作處理下玉米有較充足的物質(zhì)源(主要包括可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉等)為籽粒灌漿奠定基礎(chǔ)。

2.6 玉米平菇間作對玉米產(chǎn)量和土地當量的影響

與單作玉米相比，2017年、2018年間作玉米百粒重分別增加了20.8%、3%，穗粒重增加了3.7%、2.3%(表4)。兩年間，玉米凈增產(chǎn)量為376 kg·hm-2、325 kg·hm-2，同時，平菇凈增產(chǎn)量為16 560 kg·hm-2、14 064 kg·hm-2，LER均大于1，分別為2.5和2.4，間作產(chǎn)量優(yōu)勢明顯。

表3 不同種植模式、時期及其相互作用對玉米光合作用5種關(guān)鍵酶的影響

表4 玉米產(chǎn)量構(gòu)成因素及土地當量比

3 討論與結(jié)論

光合作用合成有機物，是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)[34-36]，作物光合作用能力強弱通常可以用凈光合速率(PN)來衡量。CO2是作物進行光合作用的重要原料，有研究顯示作物光合作用會隨CO2濃度(不超過500 μmol·mol-1)的升高而增強[37]。研究棉田套種平菇、玉米間作平菇試驗表明，間作系統(tǒng)有助于調(diào)節(jié)光照、溫度及水分等資源[38]，平菇出菇良好，并釋放出大量的CO2，為棉株和玉米光合作用提供較為充足的原料，并提高了光合效率，促進棉花和玉米生育后期生物量的累積[39-40]。本研究表明，一茬菇期，間作體系下玉米穗位葉最大光化學效率(Fv/Fm)和PN較單作分別提高了4%和15.6%，二茬菇期，間作玉米PN比單作提高了25.7%，這可能是因為間作期內(nèi)的田間溫濕度適宜，其中空氣溫度、空氣濕度分別比單作玉米提高了3.6%和9.1%，同時CO2濃度增加了22.5%，玉米光合作用可利用碳源增加，促使玉米穗位葉的光合速率提高，籽粒灌漿期間將有更多的光合物質(zhì)向籽粒運輸和分配。無菇期，間作體系下的空氣溫濕度和CO2濃度逐漸下降，與單作玉米環(huán)境條件趨于一致，且間作玉米穗位葉的Fv/Fm、PN較單作無明顯差異。另外，與單作玉米相比，間作處理增加了玉米和平菇產(chǎn)量，土地當量比提高，這與很多間作系統(tǒng)研究[15,17,41]的結(jié)論相符。

玉米穗位葉的Rubisco、PEPC、MDH、NADP-ME和PPDK等酶活性，在一定程度上反映了碳素同化的效率高低[42]。研究表明，玉米抽絲期(無菇期)-灌漿期(二茬菇)穗位葉的Rubisco、NADP-ME和PPDK酶活性顯著降低，這與春玉米吐絲期-灌漿期-成熟期光合作用Rubisco等酶活性呈現(xiàn)逐漸降低變化趨勢的研究一致[43]。

植物生長季，Rubisco的羧化效率提高(5%～25%)，將促進葉片的光合速率，并可能使干物質(zhì)產(chǎn)量增加幾倍[44]。研究表明，二茬菇期，間作的Rubisco酶活性較單作提高13%，可能促進玉米葉片光合作用并有利于干物質(zhì)積累。與單作玉米相比，二茬菇間作處理的穗位葉MDH酶活性顯著提高(P<0.05)，且NADP-ME、PEPC和PPDK酶活性分別提高了12%、74%和14%。同時，間作處理平菇生長釋放大量的CO2，若玉米葉片有效吸收，PEPC酶同化CO2生成更多的草酰乙酸，原料的增加和MDH酶活性的顯著提高，將催化較多的草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，而蘋果酸經(jīng)NADP-ME酶氧化脫羧生成較為充足的丙酮酸和CO2，而Rubisco酶活性提高對CO2同化過程中起關(guān)鍵作用，這一過程可能會有效調(diào)節(jié)玉米穗位葉的光合速率，積累較多的光合產(chǎn)物，為生育中后期玉米籽粒灌漿奠定基礎(chǔ)[45]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，活化的Rubisco量(而不是Rubisco的總量)會影響植物光合速率[46]，主要原因是鈍化態(tài)Rubisco的羧化/加氧活性需要通過Rubisco活化酶調(diào)節(jié)[47]。無菇期，間作處理光合速率比單作低，可能是由于間作玉米活化的Rubisco量較少，以及MDH、NADP-ME、PEPC、PPDK酶活性較低導致的。

綜上，在高光效種植模式下玉米間作平菇共生期內(nèi)，田間作物群體內(nèi)空氣濕度和CO2濃度顯著提高，在平菇生長旺盛期(8月11日)，間作玉米的凈光合速率、5種關(guān)鍵酶活性、3種光合產(chǎn)物都高于單作玉米，這為玉米生長提供了更為適宜的生長環(huán)境，并為其光合作用提供較為充足的碳源，促進了玉米生長中后期(灌漿期-成熟期)光合效率的提高和產(chǎn)物的累積，玉米產(chǎn)量增加，土地當量比提高。這將對吉林省中部地區(qū)玉米間作平菇的高產(chǎn)栽培提供一些理論支持。玉米間作平菇系統(tǒng)顯著改善了作物群體微環(huán)境條件，可能會對不同層位玉米葉片產(chǎn)生影響，另外，平菇(真菌界擔子菌門)與根際土壤微生物相互作用和物質(zhì)能量交換，這都會影響玉米光合產(chǎn)物積累與分配，因而都值得進一步深入研究。