灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗提液酶學特性研究

吳媛媛 吳偉杰 郜海燕 孫 健 劉瑞玲 陳杭君 韓延超

(1南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210012；2浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室/浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室/中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室,浙江 杭州 310021；3廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西 南寧 530070)

灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)屬半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)葡萄孢屬(Botrytis),是一種植物病原真菌。由灰葡萄孢霉引起的灰霉病是造成草莓[1]、藍莓[2]等水果采前和采后損失的重要原因。灰葡萄孢霉致病過程較復雜,病原菌入侵植物,首先需要分泌水解酶來突破其表皮的第一道屏障——角質(zhì)層[3],角質(zhì)層破損后病原菌進一步生長,從而導致植物組織腐爛。通常角質(zhì)以C16和C18為底物通過酯鍵連接形成,是一種高聚物[4],而角質(zhì)酶夠分解角質(zhì)、甘油三酯等化合物并產(chǎn)生大量脂肪酸[5],因此角質(zhì)酶是入侵植物最主要的功能酶[6]。角質(zhì)酶也是誘導酶,經(jīng)其降解的角質(zhì)單體能夠誘發(fā)病原細胞中角質(zhì)酶基因的持續(xù)表達并分泌更多角質(zhì)酶,因此寄主體表的角質(zhì)被降解后,更易受到病原菌侵染[7]。

角質(zhì)酶能影響并削弱寄主抗病性,是果實采后保鮮技術的關鍵控制點。開展角質(zhì)酶酶學性質(zhì)的研究,在果實貯藏過程中采取相關措施來抑制角質(zhì)酶活性,有助于保護果實角質(zhì)層,從而減小灰葡萄孢霉對果實的危害。目前,針對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶酶學性質(zhì)及其對葡萄角質(zhì)層降解作用的研究鮮見報道。本試驗探究了灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的最適反應溫度、最適pH 值、熱穩(wěn)定性、pH 值穩(wěn)定性以及金屬離子和有機溶劑對其粗酶活性的影響,并分析角質(zhì)酶粗提液對葡萄角質(zhì)層的降解作用,以期為控制果蔬采后病害,探究植物角質(zhì)層與抗病性的關系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)分離自藍莓,由浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室鑒定和保存[2]。

蘋果及葡萄均購于杭州市江干區(qū)石橋路農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 主要儀器與設備

DHG-9070A 電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器,松下健康醫(yī)療器械株式會社；MIR-253 恒溫培養(yǎng)搖床、MIR-253 真菌恒溫培養(yǎng)箱,SANYO Electric Co.Ltd；MSZCL-1 磁力攪拌器,鄭州長城科工貿(mào)公司；E-103E分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；Cintral 20 紫外-可見分光光度計,澳大利亞GBC 科學儀器公司；BIOFUGE Stratos 高速低溫冷凍離心機,美國Thermo公司；KYKY SBC-12 離子衍射儀,北京中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；TM3000 型掃描電鏡,日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果角質(zhì)的制備 取適量蘋果表皮浸泡于草酸緩沖液(草酸4 g·L-1和草酸銨16 g·L-1),煮沸1 h,煮沸后用蒸餾水徹底沖洗蘋果表皮,以除去草酸緩沖液。處理后的蘋果表皮置于50℃恒溫鼓風干燥箱中干燥3 h,取出后用研缽研磨成粉末。取適量蘋果皮粉末,加入氯仿-甲醇(2∶1,v/v)過夜提取,然后用分液漏斗萃取24 h,取下層萃取液,待萃取液揮發(fā)至干即得角質(zhì)[8]。

1.3.2 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶培養(yǎng)液制備 分別稱取0.6 g NaNO3、0.6 g K2HPO4、0.2 g MgSO4、0.2 g KCl、0.01 g FeSO4·7H2O 及0.2%蘋果角質(zhì),用蒸餾水定容至1 000 mL[9],配制成角質(zhì)酶培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液分裝至250 mL 三角瓶中,裝液量為100 mL,經(jīng)121℃濕熱滅菌25 min 后備用。

1.3.3 角質(zhì)對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的誘導 參照王飛[8]的方法。從已分離鑒定的灰葡萄孢菌種上挑取少量菌絲,接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中22℃恒溫培養(yǎng)。取培養(yǎng)7 d 的灰葡萄孢霉,制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸浮液。取10 mL 孢子懸浮液接種于1.3.2 制備的培養(yǎng)液中,然后置于25℃條件下120 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)6 d。每隔1 d 取10 mL 灰葡萄孢霉培養(yǎng)液,用4 層紗布過濾除去菌絲,然后于4℃條件下10 000 r·min-1離心20 min,保留上清液,即為灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶液。

1.3.4 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶酶活的測定 取200 μL 粗酶提液,加入200 μL 0.4%Triton X-100 和1 380 μL 50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 值7.0),混合后于35℃條件下水浴2 min,再加入20 μL 丁酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl butyrate,PNB)作為反應底物,于405 nm波長處測定并記錄3 min 內(nèi)反應液的吸光度值的變化速率[10]。以直接沸水浴5 min 處理后的粗酶液為對照。以35℃時每分鐘催化PNB 水解生成1 μmol 對硝基酚的酶量為一個酶活單位(U)：

式中,△OD為1 min 內(nèi)吸光值度的變化；Ⅴ為反應液體積,mL；ε 為消光摩爾系數(shù)6 830 L·mol-1·cm-1,pH 值7.0；Ⅴ1為反應液中酶液體積；b 為比色皿光程,cm；T 為反應時間,min。

1.3.5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應溫度及熱穩(wěn)定性測定 最適反應溫度的選擇：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎上,將水浴溫度分別設置為25、35、45、55、65℃,水浴2 min 測定不同水浴溫度下的粗酶活性,并依據(jù)粗酶活性判斷灰葡萄孢霉角質(zhì)酶最適反應溫度。

熱穩(wěn)定性測定：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎上,將水浴溫度分別設置為25、35、45、55、65℃,于不同水浴溫度下每隔2 h 測定粗酶活性,進而判斷不同反應溫度下粗酶的穩(wěn)定性。

1.3.6 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應pH 值及pH穩(wěn)定性測定 最適反應pH 值的選擇：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎上,將磷酸緩沖液pH 值分別設置為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,測定不同pH 值磷酸緩沖液下的粗酶活性,并依據(jù)粗酶活性判斷灰葡萄孢霉角質(zhì)酶最適pH 值。

pH 值穩(wěn)定性測定：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎上,將粗酶液按1∶9 的比例與不同pH 值(6～9.0)的緩沖液稀釋混勻,并于25℃水浴條件下每隔2 h 測定粗酶活性,進而判斷不同pH 值下粗酶的穩(wěn)定性[11]。

1.3.7 金屬離子、有機溶劑對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活力的影響 在5 mL 粗酶樣品中分別加入金屬離子(Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋和Fe3＋),調(diào)節(jié)金屬離子和EDTA 終濃度為10 mmol·L-1,于4℃條件下放置1 h,按照1.3.4 所述方法測定粗酶活性。以加入等量蒸餾水的粗酶液作為對照,設定對照酶活為100%[12]。

分別向5 mL 粗酶樣液中加入0.56 mL 丙酮、甲醇、異丙醇、乙醇、乙腈和三氯甲烷,使有機溶劑體積分數(shù)均為10%[13],于4℃放置1 h,按照1.3.4 所述方法測定粗酶活性。以加入等量蒸餾水的粗酶液為對照組,設定對照組酶活為100%。

1.3.8 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對葡萄角質(zhì)層的影響

挑選外表皮蠟質(zhì)保持完好的葡萄果實,將10 mL 粗酶液均勻噴灑于果實表面,以噴灑高溫煮沸失活的粗酶液為對照,每組處理10 個葡萄果實。處理后的葡萄果實置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,然后在葡萄赤道附近切取面積厚約1 mm 的果皮置于載玻片,并于-80℃超低溫冰箱冷凍后真空冷凍干燥24 h。干燥的樣品用離子衍射儀鍍金,厚度約20 nm,鍍金結(jié)束后進行掃描電鏡觀察拍照[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理,應用Origin 8.5 軟件繪制圖形,并以SAS 9.2軟件采用Duncan’s 和LSD 多重比較對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P＜0.05)。所有試驗均設3 次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響

由圖1可知,培養(yǎng)3 d 時角質(zhì)酶粗酶相對酶活最高,第4 天時顯著下降(P＜0.05),第4 天時角質(zhì)酶活僅為最高角質(zhì)酶活的16.41%。這可能與培養(yǎng)液中的碳源有關,本試驗以角質(zhì)為唯一碳源,灰葡萄孢霉分泌角質(zhì)酶降解角質(zhì)以獲取營養(yǎng),隨著培養(yǎng)時間延長,角質(zhì)逐漸消耗,在第4 天角質(zhì)酶活開始下降。因此本試驗選取培養(yǎng)后第3 天作為酶活測定的時間點。

2.2 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

由圖2-A可知,水浴溫度為35℃時角質(zhì)酶粗酶相對酶活最高,顯著高于25、45、55℃時的相對酶活(P＜0.05)；當水浴溫度在為25℃時,其相對酶活僅為35℃時相對酶活的29.59%；45℃與55℃水浴處理組無顯著差異(P＞0.05),分別為最高酶活的75.12%與70.93%。粗酶在55℃時仍保留60%以上的酶活,表明灰葡萄孢霉粗酶中的角質(zhì)酶具有較好的耐熱性。

由圖2-B可知,在不同時長的水浴條件下,角質(zhì)酶在25℃和35℃條件下較穩(wěn)定,水浴第8 小時,其相對酶活依然保持90%以上；水浴溫度高于45℃時,隨著溫度的升高,酶的熱穩(wěn)定性逐漸降低,經(jīng)8 h 水浴,水浴溫度為45℃時殘余酶活為83.18%,55℃時為70.0%,65℃時為59.1%,仍保持50%以上酶活。表明角質(zhì)酶粗酶熱耐受性較好,屬于中度耐熱型酶。

圖1 培養(yǎng)時間對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響Fig.1 Effect of culture time on the activity of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.3 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適pH 值與pH 值穩(wěn)定性

pH 值也是影響角質(zhì)酶活的重要因素之一。由圖3-A可知,角質(zhì)酶粗酶酶活受反應體系pH 值的影響較大,其最適pH 值為7.5,偏堿性環(huán)境各組(pH 值在8.0～9.0 之間)間無顯著差異(P＞0.05)。當反應體系pH 值為9.0 時,其相對酶活為72.65%。偏酸性環(huán)境各組間也無顯著差異(P＞0.05),當反應體系pH 值為6.0 時,其相對酶活僅為43.12%。表明,角質(zhì)酶在偏堿性環(huán)境中相對酶活較高,在pH 值低于7.5 時酶活顯著下降(P＜0.05)。

圖2 溫度對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性(A)及熱穩(wěn)定性(B)的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity(A)and stability(B)of crude cutinase from Botrytis cinerea

由圖3-B可知,角質(zhì)酶在pH 值為7.5 的體系中酶活較穩(wěn)定,經(jīng)8 h 水浴,其殘余酶活仍為102.14%。；在pH 值為6.0 時,酶活最不穩(wěn)定,2 h 后酶活急劇下降,至8 h 僅為初始酶活的35.02%。當pH 值大于7.5時,隨著pH 值的升高,角質(zhì)酶穩(wěn)定性逐漸下降；當pH值小于7.5 時,隨著pH 值下降,角質(zhì)酶在酸性體系中穩(wěn)定性變差。

圖3 pH 值對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性(A)及pH 值穩(wěn)定性(B)的影響Fig.3 Effect of pH value on the activity(A)and stability(B)of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.4 金屬離子和有機溶劑對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響

由圖4-A可知,Na＋、Mg2＋、Ca2＋對角質(zhì)酶粗酶酶活具有顯著促進作用(P＜0.05),其中Na＋的作用最顯著,達到127.08%。Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋對角質(zhì)酶粗酶酶活具有顯著抑制作用(P＜0.05),尤其是Fe3＋,僅保留52.02%的殘余酶活,Zn2＋保留70.72%的殘余酶活,Cu2＋保留79.17%的殘余酶活。

由圖4-B可知,有機溶劑中甲醇對角質(zhì)酶粗酶酶活有顯著促進作用(P＜0.05),相比對照組提高了18.11 個百分點,丙酮與異丙醇具有促進作用(P＜0.05),酶活提高5.46 個百分點。而乙醇、乙腈與三氯甲烷有顯著抑制作用(P＜0.05),其中乙醇處理后酶活降低了34.95 個百分點,乙腈處理后酶活降低了27.75 個百分點,三氯甲烷處理后酶活降低了36.18個百分點。角質(zhì)酶在有機溶劑中酶活不同可能是由于二級或三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應的變化[15]。

圖4 金屬離子(A)和有機溶劑(B)對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響Fig.4 Effect of metal ions(A)and organic solvent(B)on activity of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對葡萄角質(zhì)層的降解

由圖5-A可知,噴灑失活角質(zhì)酶粗酶的葡萄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)致密,分布均勻以鱗片形式存在,表皮蠟質(zhì)無明顯降解。而未失活粗酶處理后,表皮蠟質(zhì)出現(xiàn)明顯降解,出現(xiàn)降解部分與正常部分分界線(圖5-B)。正常部分蠟質(zhì)完好,均勻致密,而降解部分出現(xiàn)類似于蠟質(zhì)溶解的現(xiàn)象,蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,與完好蠟質(zhì)差異明顯。角質(zhì)層作為保護果實的第一道屏障,當表皮蠟質(zhì)降解后,這道保護層遭到破壞,使角質(zhì)層內(nèi)層暴露在外,更易受到病原菌侵染。

圖5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對葡萄角質(zhì)層的影響Fig.5 Effect of crude cutinase from Botrytis cinerea on grape’s cuticle

3 討論

灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶的最適反應溫度為35℃,大多數(shù)真菌角質(zhì)酶的最適溫度為30～40℃,這與本研究結(jié)果基本一致。細菌角質(zhì)酶比真菌角質(zhì)酶更耐熱,如嗜熱細菌Thermobifi da fusca角質(zhì)酶最適溫度為60℃[16],大多數(shù)細菌角質(zhì)酶最適溫度為 40～60℃[17-18]。水果采后通常在高溫的夏季,為角質(zhì)酶提供了適宜的溫度,使果實更易受到灰葡萄孢霉的侵染,因此采后應盡快進行預冷處理,一方面有助于消除田間熱,另一方面能夠抑制角質(zhì)酶活性,減少灰霉病害。除最適溫度外,酶的熱穩(wěn)定性也受溫度的影響。本研究表明,灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶在35～55℃穩(wěn)定性良好,孵育8 h 后在55℃條件下酶活仍能達到70.0%,說明此角質(zhì)酶具有較強熱穩(wěn)定性。有研究報道畫眉草彎孢霉的角質(zhì)酶在40℃孵育20 min,酶活可下降50%[9],與本研究結(jié)果不一致可能與菌株不同有關。也有研究發(fā)現(xiàn)通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)NRRL B-16117 角質(zhì)酶在50～60℃條件下可保持高度穩(wěn)定性[19],真菌Fusarium solani pisi角質(zhì)酶在60℃條件下水浴5 min 后即喪失50%酶活[20],說明角質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性受菌種來源的影響。

最適pH 值與pH 值穩(wěn)定性是酶蛋白的重要性質(zhì),最適pH 值不是一個特征常數(shù),隨底物種類、濃度、溫度及緩沖液成分變化而變化。本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶的最適pH 值為7.5,符合大部分角質(zhì)酶最適pH 值為6.0～10.0[17,20],畫眉草彎孢霉角質(zhì)酶最適pH 值為7.5[9]?；移咸焰呙菇琴|(zhì)酶在pH 值為7.5 時穩(wěn)定性較高,且偏堿性環(huán)境中酶的pH 穩(wěn)定性比偏酸條件下更高。煙草赤星病菌在pH 值為5.0～9.0 時酶活較穩(wěn)定,在35℃條件下孵育1 h 后,在pH 值為9.0的體系中穩(wěn)定性較高[21],這種差異也可能與菌種不同有關。

金屬離子也會影響酶的活性[22]。Na＋、Mg2＋、Ca2＋對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的酶活有促進作用,Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋抑制粗酶活性,這與L3-2 胞外酯酶粗酶[14]、重組Thermobifida fusca角質(zhì)酶[23]的相關研究結(jié)果基本一致。Mg2＋、Ca2＋對灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶具有輕微促進作用,Mg2＋對膠紅酵母角質(zhì)酶酶活具有激活作用[24],這是因為高濃度金屬離子與角質(zhì)酶表面相關基團作用,改變酶的三級結(jié)構(gòu)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)10%乙醇處理能夠明顯降低角質(zhì)酶活性,王莉[15]發(fā)現(xiàn)在37℃時,角質(zhì)酶在20%～50%乙醇中具有較好的穩(wěn)定性,可能是由于角質(zhì)酶在不同體系中酶的構(gòu)象不同,導致其活性不同。黃曉杰[26]發(fā)現(xiàn)采后乙醇處理能有效抑制藍莓果實貯藏期間腐爛指數(shù)的上升,可能是由于乙醇處理在一定程度上抑制了灰葡萄孢霉角質(zhì)酶活性。因此乙醇處理在葡萄采后保鮮應用中具有良好的應用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對葡萄角質(zhì)層蠟質(zhì)具有明顯的降解作用。Schweizer 等[27]研究發(fā)現(xiàn)真菌病原體禾白粉菌(Erysiphe graminisf.sp.hordei)能夠降解大麥角質(zhì)層,釋放角質(zhì)單體,也驗證了游離角質(zhì)單體能夠激活植物防御反應。目前,關于葡萄角質(zhì)層降解后產(chǎn)物尚不明確,其蠟質(zhì)或角質(zhì)降解產(chǎn)物是否具有誘導抗病性的作用還有待進一步研究。也有研究表明植物蠟質(zhì)在逆境脅迫下,相關合成基因表達會發(fā)生變化,以抵御外界環(huán)境的侵害[28]。后續(xù)可利用分子生物學技術繼續(xù)探究葡萄角質(zhì)層被灰葡萄孢霉降解后蠟質(zhì)和角質(zhì)相關基因的變化。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應溫度為35℃,最適反應pH 值為7.5,具有良好的耐熱性與耐堿性,金屬離子Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋,有機溶劑乙醇對酶活具有抑制作用,同時角質(zhì)酶粗酶對葡萄角質(zhì)層具有降解作用。為灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶酶活抑制因子的發(fā)現(xiàn)及果實采前處理或采后貯藏技術提供了一定的理論基礎,同時為角質(zhì)酶對植物角質(zhì)層的降解作用提供了參考。角質(zhì)酶與葡萄角質(zhì)層之間的相互作用以及降解產(chǎn)物對葡萄抗病性的影響還有待進一步研究。