卞玉瑩，王 成，顧萬建，倪吳花，張春妮△

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗科，江蘇南京210002；3.江蘇省中醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210029；4.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，浙江溫州 325000)

男性不育癥發(fā)病率逐年升高，已成為全球性的健康問題。男性不育癥發(fā)病機制復雜，可由先天或繼發(fā)性泌尿生殖系統(tǒng)異常、生殖腺感染、內分泌紊亂、精索靜脈曲張、線粒體功能障礙或免疫學等因素引起，其中特發(fā)性不育癥患者約占40%，其分子機制尚不完全明確[1]。最新研究表明，精漿含有大量外泌體，來源于男性生殖系統(tǒng)多種細胞，由于精漿外泌體微小RNA(miRNA)的水平會伴隨外泌體起源細胞的變化而改變，因此其能夠更精確地反映生殖器官的病理、生理變化，可作為潛在的生物標志物[2]。有報道顯示，微小RNA-202-5p(miR-202-5p)是一種高表達于成年男性睪丸組織中的miRNA[3]，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的生理功能[4]。目前，關于miR-202-5p在男性不育癥精漿外泌體中的變化情況未見報道；因此，本研究通過分析miR-202-5p在男性不育癥患者精漿外泌體中的水平變化，初步預測了其在男性不育癥發(fā)生、發(fā)展過程中潛在的分子機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015-2019年在解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、江蘇省中醫(yī)院及溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診的男性不育癥患者107例為研究對象，年齡18～44歲，平均(29.8±6.5)歲。按照WHO診斷標準[5]，包括非梗阻性無精癥患者53例(精液標本經(jīng)1 500×g，離心15 min后沉淀，鏡檢無精子≥2次)，弱精癥患者54例[精子密度>15×106/mL，a+b級精子<32%，總活力<40%]。所有不育癥患者均為婚后夫妻性生活正常，未行避孕措施2年以上而未能生育者。同期募集健康男性53例為對照組，年齡19～53歲，平均(28.4±6.7)歲，精液常規(guī)分析各項指標均在正常范圍內，均已正常生育。納入標準：在采樣期間均未服用過任何藥物者；對本研究知情同意者。排除標準：泌尿、生殖、造血、內分泌系統(tǒng)疾病及其他慢性疾病和接受過放、化療者。

1.2儀器與試劑 計算機輔助精液分析系統(tǒng)(WLJY-9000精子分析儀，北京偉力公司)；B320A型低速離心機(河北白洋離心機廠)；BS60型恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設備廠)；XW-80A型漩渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)；LightCycler?96實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(瑞士Roche公司)；2720型PCR儀(美國ABI公司)；ExoQuick尿液外泌體分離試劑盒(美國SBI公司)；磷酸鹽緩沖液(美國Thermo Fisher公司)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；miR-202-5p PCR引物和TaqMan探針(美國Thermo Fisher公司)；反轉錄體系和qRT-PCR體系所用試劑(AMV反轉錄酶、dNTP、rTaq酶、buffer及MgCl2)均購自TaKaRa公司。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集 所有研究對象標本采集前禁欲3～7 d，自慰法取精液于干燥消毒的無菌容器中，置于37 ℃溫育30 min，液化后進行精液常規(guī)檢查。精液在取樣2 h內，1 500×g離心10 min去除精子細胞得到精漿，-80 ℃保存。

1.3.2精漿外泌體提取 將精漿標本在4 ℃，3 000×g離心15 min，取100 μL上清液溶于150 μL 磷酸鹽緩沖液，根據(jù)外泌體提取試劑盒說明書加入63 μL ExoQuick試劑，混勻后離心提取外泌體。

1.3.3精漿外泌體總RNA提取 按本課題組前期建立的方法[6]，用Trizol法提取外泌體中的總RNA，每個精漿標本均在提取過程中加入20 μL外源性參照(人工合成源自植物金銀花的miR-2911成熟體，序列為5′-GGC CGG GGG ACG GGC UGG GA-3′)用于校正RNA提取效率和誤差，提取后的總RNA溶于25 μL不含RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水，保存于-80 ℃待用。

1.3.4qRT-PCR檢測 采用基于TaqMan探針的qRT-PCR[7]檢測精漿外泌體miR-202-5p水平。反轉錄PCR反應體系10 μL：DEPC水3.5 μL，5×反轉錄緩沖液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，AMV 反轉錄酶 0.5 μL，miR-202-5p反轉錄引物1.0 μL，RNA標本2.0 μL。反應條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，每個反應均為1個循環(huán)。qRT-PCR反應體系為20 μL：ddH2O 14.77 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，rTaq酶0.3 μL，miR-202-5p上、下游引物和TaqMan 探針0.33 μL，cDNA 1.0 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用相對定量2-ΔCt法，通過儀器配套的LightCycler?96分析軟件對檢測結果設定統(tǒng)一的閾值，分析獲得的Ct值(表示每個PCR管內的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，其中ΔCt = Ct(miR-202-5p)-Ct(miR-2911)。每個Ct值均為相應標本重復檢測3次后所得均值。

2 結 果

2.1精漿外泌體miR-202-5p水平比較 qRT-PCR結果顯示，與對照組miR-202-5p水平[0.027(0.011，0.056)]比較，弱精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平[ 0.048(0.023，0.137)]明顯增加(P<0.05)，無精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平[ 0.008(0.004，0.014)]明顯降低(P<0.05)；無精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平較弱精癥患者明顯降低(P<0.05)。

2.2ROC曲線分析 ROC曲線分析結果顯示，精漿外泌體miR-202-5p診斷弱精癥的曲線下面積(AUC) 為0.664(95%CI：0.562～0.766)，診斷無精癥的AUC為0.785(95%CI：0.698～0.872)，對弱精癥和無精癥患者鑒別診斷的AUC為0.878(95%CI：0.816～0.940)。

2.3男性不育癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平與精液參數(shù)的相關性 Spearman相關分析結果顯示，弱精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平與a+b級前向運動精子比例呈負相關(r=-0.312，P<0.05)，與不動精子比例呈正相關(r=0.308，P<0.05)，而與精子濃度無相關性(r=0.102，P>0.05)。

2.4Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結果顯示，當以對照組為參考變量時，精漿外泌體miR-202-5p是弱精癥(OR=2.728，95%CI：1.224～6.080，P<0.05)和無精癥(OR=5.417，95%CI：2.148～13.660，P<0.05)發(fā)生的危險因素。

2.5miR-202-5p靶基因預測 3種生物信息學分析軟件共同預測了128種miR-202-5p潛在的靶基因，見圖1。通過Metascape[8]進行靶基因功能注釋和富集通路分析，發(fā)現(xiàn)miR-202-5p靶基因明顯富集于胚胎發(fā)育、組蛋白修飾、細胞分化、信號轉導等與生殖和精子功能密切相關的蛋白調控通路，見圖2。miR-202-5p預測靶蛋白間相互作用網(wǎng)絡分析見圖3。

注：圖中數(shù)字為靶基因種類，3種生物信息學軟件共同預測了128種靶基因。

圖1 miR-202-5p靶基因的生物信息學預測

圖2 miR-202-5p富集通路分析

注：MCODE1為蛋白TGFBR2、TGFBR1、USP15、ACVR1相互作用網(wǎng)絡；MCODE2為蛋白RNF2、DDX3X、TARDBP、HNRNPR相互作用網(wǎng)絡。

圖3 miR202-5p預測靶蛋白間相互作用網(wǎng)絡

3 討 論

外泌體可由多種不同類型細胞分泌并穩(wěn)定存在于幾乎人體所有體液中，包括血漿、血清、唾液、母乳、腦脊液、尿液和精液[9]，其可被特定靶細胞吸收，從而在細胞間通訊和信息交流過程中發(fā)揮重要作用[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中富含大量miRNA，能保護其不被水解[10]。目前，男性不育癥患者精漿外泌體miRNA成為研究的熱點。VOJTECH等[2]率先發(fā)現(xiàn)精漿外泌體含有大量miRNA,并顯示出獨特的miRNA表達譜。ABU-HALIMA等[11]研究發(fā)現(xiàn),在弱精癥患者精漿外泌體中miR-765和miR-1275的表達水平明顯升高，而miR-15a的表達水平明顯降低。此外，BARCELO等[12]比較了不同病理類型無精癥患者間精漿外泌體miRNA表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)5種miRNA(miR-182-3p、miR-205-5p、miR-31-5p、miR-539-5p和miR-941)可作為分泌型無精癥患者潛在的生物標志物。上述研究均提示,精漿外泌體miRNA表達改變將有助于男性不育癥分子標志物的開發(fā)及分子機制研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育癥患者和對照組精漿外泌體miR-202-5p水平存在差異，相較于對照組，弱精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平明顯增加，而無精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平明顯降低，提示精漿外泌體miR-202-5p有望成為男性不育癥的輔助診斷指標。YANG等[3]通過測序發(fā)現(xiàn)，miR-202-5p在成人睪丸中明顯富集；DABAJA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸組織中miR-202-5p主要定位于支持細胞，當生殖細胞存在時，miR-202-5p在支持細胞中高表達，這種生殖細胞依賴性表達提示miR-202-5p在支持細胞成熟、精子形成中具有調控功能；此外，QIU等[4]通過熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)miR-202-5p在精子發(fā)生過程中始終存在。本研究推測無精癥患者由于精子發(fā)生障礙，生殖細胞缺乏，導致精漿外泌體miR-202-5p水平下降；而弱精癥患者由于精子功能發(fā)生改變，導致凋亡增加，從而使睪丸等生殖組織外泌體分泌增加，這可能是其精漿外泌體miR-202-5p水平升高的潛在機制。本研究ROC 曲線分析結果顯示，精漿外泌體miR-202-5p對弱精癥和無精癥的鑒別診斷價值(AUC=0.878)較高，提示精漿外泌體miR-202-5p有望成為男性不育癥的鑒別診斷指標。相關性分析結果顯示，弱精癥患者精漿外泌體miR-202-5p水平與a+b級前向運動精子比例密切相關，結合Logistic回歸分析的結果，精漿外泌體miR-202-5p是弱精癥和無精癥發(fā)生的危險因素，提示其可能參與了精子發(fā)生和精子運動。

生物信息學分析結果顯示，miR-202-5p的靶基因明顯富集于精子功能及生殖等相關的蛋白調控通路，且參與調控細胞的增殖、分化與凋亡。miR-202-5p靶基因相互作用網(wǎng)絡的幾個關鍵蛋白(TGFBR2、DDX3X、RNF2、TARDBP)已被報道與不育癥密切相關：YUAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在隱睪癥大鼠模型中通過激活TGFBR2信號通路誘導精原細胞凋亡，可降低睪丸的生長速度； CHE等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-322的下調通過靶向DDX3X能促進小鼠精母細胞的凋亡；MAEZAWA等[16]研究發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生過程中，大量對男性生育能力至關重要的生殖基因包括RNF2被協(xié)調激活；VARGHESE等[17]研究發(fā)現(xiàn),TARDBP的異常表達與男性精子生成障礙有關。以上結果均表明精漿外泌體miR-202-5p的部分靶基因與男性生殖細胞形成及精子發(fā)生的機制密切相關，而本研究篩選出的未被證實的靶基因還有待進一步研究驗證。

4 結 論

綜上所述，精漿外泌體miR-202-5p在弱精癥患者中高表達，在無精癥患者中低表達，并與精子活力有較高相關性，是弱精癥和無精癥發(fā)生的危險因素；此外，miR-202-5p對男性不育癥的診斷和鑒別具有一定臨床價值。miR-202-5p可能參與了男性生殖的發(fā)生、發(fā)展，為男性不育癥的分子機制研究提供了新的思路和理論依據(jù)。