劉芳 徐細(xì)明

[摘要] 目的 探討細(xì)胞周期相關(guān)因子3（CDCA3）在肝癌中的生物學(xué)行為。 方法 收集2018年1月～2019年6月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)治療的肝細(xì)胞肝癌患者的組織標(biāo)本，共30例肝癌標(biāo)本和癌旁標(biāo)本;分別采用Real-Time PCR檢測不同組織中的CDCA3的表達情況;采用lip3000轉(zhuǎn)染法分別將CDCA3干擾RNA序列和對照序列轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株，應(yīng)用CCK-8、EdU免疫熒光染色檢測細(xì)胞增殖，流逝細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果 肝癌組織CDCA3的表達量明顯高于癌旁組織，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。HepG2、Huh7、SMMC-7721細(xì)胞中CDCA3的表達量明顯高于LO2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），而BEL-7402細(xì)胞中CDCA3的表達量與LO2細(xì)胞的表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3的表達量與對照組（siNC）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05），故選取SMMC-7721細(xì)胞完成后續(xù)研究。siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3的表達量后，24 h和48 h細(xì)胞增殖數(shù)明顯低于siNC，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。并且EdU檢測陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于siNC。siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3表達量后，細(xì)胞周期的G1期時間較siNC延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 CDCA3能夠促進肝癌細(xì)胞增殖，是潛在的治療靶點。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞周期相關(guān)因子3;肝癌;增殖;細(xì)胞周期

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（b）-0014-06

Study on the role of CDCA3 in the proliferation of hepatocellular carcinoma

LIU Fang? ?XU Ximing

Cancer Center， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To investigate the biological behavior of cell division cycle associated protein 3 （CDCA3） in liver cancer. Methods Tissue specimens of hepatocellular carcinoma patients who underwent surgical treatment in the Department of Hepatobiliary Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University from January 2018 to June 2019 were collected. There were 30 liver cancer specimens and paracancer specimens. Real-time PCR was used to detect the expression of CDCA3 in different tissues. CDCA3 interfering RNA sequences and control sequences were transfected into hepatocellular carcinoma cell lines by lip3000 transfection. Cell proliferation was detected by CCK-8 and EdU immunofluorescence staining， and cell cycle was detected by elapse cytology. Results The expression level of CDCA3 in liver cancer tissues was significantly higher than that in paracancer tissues， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The expression levels of CDCA3 in HepG2， Huh7 and SMMC-7721 cells were significantly higher than those in LO2 cells， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）， while the expression level of CDCA3 in BEL-7402 cells was not statistically significant compared with that in LO2 cells （P > 0.05）. The expression of CDCA3 in SMMC-7721 cells down-regulated by SiCDCA3#1 and siCDCA3#2 was statistically significant compared with that in the control group （siNC） （P < 0.05）. Therefore， SMMC-7721 cells were selected to complete the follow-up study. After the expression levels of CDCA3 in SMMC-7721 cells were down-regulated by siCDCA3#1 and siCDCA3#2， the number of cell proliferation at 24 h and 48 h was significantly lower than that in the siNC， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. And the number of positive cells detected at EdU was significantly lower than that in the siNC. Compared with the siNC， the G1 phase time of SMMC-7721 cell cycle was prolonged after the expression of CDCA3 in SMMC-7721 cell was down-regulated by siCDCA3#2， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion CDCA3 can promote the proliferation of liver cancer cells and is a potential therapeutic target.

[Key words] Cell division cycle associated protein 3; Liver cancer; Proliferation; Cell cycle

原發(fā)性肝癌（以下簡稱“肝癌”）是臨床常見的惡性腫瘤，位居世界癌癥死亡率第5位，5年生存率約為18%[1]。早期肝癌患者的治療主要以手術(shù)或局部消融為主，中晚期患者則多采用介入、放化療或靶向等手段[2-3]。受限于當(dāng)前缺少足夠特異和有效的手段針對高危人群進行早期診斷和臨床前篩查，因此，當(dāng)肝癌確診時腫瘤已演進多時，導(dǎo)致僅有約1/3的患者適合手術(shù)切除。以上種種因素導(dǎo)致了肝癌患者往往容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，5年生存率仍處于較低水平[4]。鑒于當(dāng)前所面臨的種種困境，尋找肝癌相關(guān)標(biāo)志物，研究其調(diào)控的分子機制，具有重要的理論和臨床意義。

前期的研究中，筆者團隊通過基因芯片技術(shù)在肝癌組織和癌旁組織中篩選出具有差異表達的信使RNA（mRNA）[5-6]。基因芯片數(shù)據(jù)表明肝癌組織中細(xì)胞周期相關(guān)因子3（cell division cycle associated protein 3，CDCA3）的mRNA表達水平較正常肝組織高。CDCA3，又稱Tome-1，是細(xì)胞進行有絲分裂過程中所必需的胞質(zhì)蛋白，其調(diào)控著細(xì)胞周期的進展[7]。它可以通過淘汰素、S期激酶相關(guān)蛋白L共同參與E3連接酶復(fù)合物的構(gòu)成，與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、有絲分裂抑制激酶家族成員WEEL的泛素化和降解相關(guān)，它是細(xì)胞進入有絲分裂的觸發(fā)器[8]，同時CDCA3也參與細(xì)胞周期G1期的調(diào)控[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CDCA3在非小細(xì)胞肺癌[7]、胃癌[10]、膀胱癌[11]、白血病[12]、結(jié)腸癌[13]、乳腺癌[9]等腫瘤中出現(xiàn)異常高表達的現(xiàn)象，表明其可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，但是在肝癌中的研究較少。本研究旨在探討CDCA3在肝癌中的作用，為肝癌的診斷及治療提供新的分子靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所選30對標(biāo)本均來自于武漢大學(xué)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）肝膽外科2018年1月～2019年6月行肝癌切除術(shù)患者所切除的肝癌組織及癌旁組織（距離手術(shù)切緣至少2 cm）。術(shù)前患者均未接受放化療、射頻消融等輔助治療，術(shù)后病理結(jié)果證實為肝細(xì)胞肝癌，患者的臨床特征如表1所示。所有標(biāo)本裝入凍存管后迅速保存于液氮中。所有標(biāo)本的獲取均經(jīng)過患者允許，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常肝細(xì)胞系LO2、人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721、Huh7和BEL-7402購買于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，HepG2、SMMC-7721和BEL-7402采用含有10%胎牛血清（Gibico，南美）和1%青-鏈霉素（谷歌生物，中國）的高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國），正常肝細(xì)胞系LO2和Huh7采用含有10%胎牛血清（Gibico，南美）和1%青-鏈霉素（谷歌生物，中國）的高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)（Thermo，美國）。按照70%高糖培養(yǎng)基，20%血清和10%二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）進行梯度凍存，保存于液氮。

1.3 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染

將生長良好處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度在70%～80%，棄培養(yǎng)基，換成無血清和抗生素的培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用lip3000（L3000015，吉凱基因，中國）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）或者對照序列（S151029151613，銳博生物，中國）用無血清培養(yǎng)基按照說明進行稀釋，室溫靜置5 min后，再輕輕地加入稀釋的lip3000，室溫孵育20 min后輕輕加入6孔板對應(yīng)的孔中。轉(zhuǎn)染6～12 h后，換用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，按照實驗所需時間收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real Time-PCR）

細(xì)胞系和組織標(biāo)本處理：用Trizol（C10268951，Invitrogen，美國）分別提取正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、30例原發(fā)性肝癌組織和對應(yīng)癌旁組織的總RNA，然后按TOYOBO試劑盒（QPK-201，上?；巧锟萍加邢薰?，日本）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

干擾CDCA3表達樣品處理：將CDCA3的siRNA及對照序列分別轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol提取總RNA，并用Nano-Drop2000C紫外分光光度計（Thermo，美國）測定RNA濃度及純度。然后按TOYOBO試劑盒（QPK-201，上?；巧锟萍加邢薰?，日本）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

最后按照Takara qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，20 μL體系，設(shè)立3個復(fù)孔，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GDPH）為內(nèi)參基因，7500 Fast System SDS軟件（BIO-RAD，美國）分析Ct值，按95 ℃ 10 min，90 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，40個循環(huán)進行擴增，采用2-△△Ct法計算相對表達量。引物序列由武漢巴菲爾生物有限公司設(shè)計合成。見表2。

1.5 細(xì)胞計數(shù)（CCK-8）檢測肝癌細(xì)胞增殖

選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，精確計數(shù)后將細(xì)胞調(diào)整為（3～4）×104個/mL接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，對細(xì)胞進行干預(yù)實驗，設(shè)置3個重復(fù)孔。分別于0、6、24、48 h，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8混合反應(yīng)液，37℃孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm的吸光度值。

1.6 EdU免疫熒光檢測肝癌細(xì)胞增殖

選?。?～4）×104個/mL的肝癌細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后對細(xì)胞進行干預(yù)實驗，設(shè)置3個重復(fù)孔。細(xì)胞干預(yù)48 h后，棄培養(yǎng)基，加入按照1000∶1的比例稀釋EdU溶液（CA1170，銳博生物，中國）孵育2 h，棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（Hyclone，美國）清洗2遍。每孔中加入50 μL 4%多聚甲醛（谷歌生物，中國）室溫孵育20 min后，棄廢液;每孔加入50 μL甘氨酸溶液（CA1170，銳博生物，中國），清洗5 min，棄廢液;用PBS清洗5 min，棄廢液;每孔加入100 μL滲透劑（0.5% Tritonx-100的PBS）脫色搖床孵育10 min，PBS清洗5 min，棄廢液;每孔中加入100 μL的1×Apollo染色反應(yīng)液（CA1170，銳博生物，中國），室溫下避光，置于脫色搖床上孵育30 min，棄廢液;加入100 μL滲透劑脫色搖床清洗2～3次，每次5 min，PBS清洗5 min;每孔加入100 μL 1×Hochest反應(yīng)液，脫色搖床室溫避光孵育30 min，棄廢液，PBS清洗3次。用倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）觀察并拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞周期檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，清洗離心后用固定液（1×）配成1×106個/mL的細(xì)胞懸液，再加入10 μL試劑B（70-APCC101，聯(lián)科生物，中國），室溫避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀分析（Becton-Dickinson，USA），采用FACS express version 3軟件分析細(xì)胞周期變化情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS 20.0（IBM，USA）對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組樣本間比較用ANOVA檢驗;計數(shù)資料采用百分率表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的圖表運用GraphPad Prism 5（GraphPad Software，CA，USA）制作。

2 結(jié)果

2.1 CDCA3在肝癌標(biāo)本中表達情況

肝癌組織CDCA3的表達量明顯高于癌旁組織的表達量，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1。進一步分析患者信息發(fā)現(xiàn)CDCA3表達量高低與患者年齡、性別、腫瘤大小、HBV病史、AFP和BCLC分期無相關(guān)性（P > 0.05）。見圖1。

2.2 CDCA3在肝癌細(xì)胞系中表達情況

HepG2、Huh7、SMMC-7721細(xì)胞中CDCA3的表達量明顯高于LO2細(xì)胞的表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）），而BEL-7402細(xì)胞中CDCA3的表達量與LO2細(xì)胞的表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。故選取HepG2、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞作為后續(xù)實驗的肝癌細(xì)胞系。

2.3 通過siRNA下調(diào)CDCA3的表達量

siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3的表達量與對照組（siNC）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）;siCDCA3#1下調(diào)Huh7細(xì)胞CDCA3的表達量與對照組（siNC）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而siCDCA3#2下調(diào)Huh7細(xì)胞CDCA3的表達量與對照組（siNC）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）;siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)HepG2細(xì)胞CDCA3的表達量與對照組（siNC）比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05），見圖3。故選取SMMC-7721作為后期研究的肝癌細(xì)胞系。

與對照組（siNC）比較，*P < 0.05。CDCA3：細(xì)胞周期相關(guān)因子3

圖3? ?不同siRNA序列與對照序列siNC分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后CDCA3表達量的比較

2.4 CCK-8檢測下調(diào)CDCA3表達量對肝癌細(xì)胞增殖的影響

siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3的表達量后，24 h和48 h細(xì)胞增殖數(shù)明顯低于對照組（siNC），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖4。

不同時間段細(xì)胞增殖數(shù)與對照組（siNC）比較

2.5 EdU檢測干擾CDCA3表達對肝癌細(xì)胞增殖的影響

siCDCA3#1和siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3的表達量后，陽性細(xì)胞數(shù)（紅色）明顯低于對照組（siNC）。見圖5（封四）。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)CDCA3對肝癌細(xì)胞周期的影響

與對照組（siNC）比較，siCDCA3#2下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3表達量后，細(xì)胞周期的G1期時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），細(xì)胞周期的S、G2期時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。而siCDCA3#1下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞CDCA3表達量后，細(xì)胞周期的G1、S、G2期時間與對照組（siNC）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖6。

3 討論

盡管分子診斷和治療策略快速發(fā)展，但目前原發(fā)性肝癌沒有特異性的治療靶點。因此，急需進一步研究發(fā)現(xiàn)更有效的肝癌生物標(biāo)志物。研究表明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的異常表達可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，推測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白抑制劑可能成為治療腫瘤的新療法[14]。在前期研究中，本課題組通過高通量測序發(fā)現(xiàn)CDCA3在肝癌組織中顯著高表達[5-6]，CDCA3是細(xì)胞進入有絲分裂的觸發(fā)器，且是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（cdk1）/細(xì)胞周期蛋白B（cyclin B）的適當(dāng)激活和細(xì)胞進入有絲分裂所必需的蛋白質(zhì)[15-16]。CDCA3編碼蛋白含有286個細(xì)胞有絲分裂的必需胞質(zhì)蛋白，通過控制有絲分裂入口從而來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[8]。細(xì)胞周期的異常調(diào)控將導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖失控，促使惡性腫瘤的形成，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。CDCA3可以通過影響DNA甲基化，從影響細(xì)胞周期的進展[17]。

為了進一步驗證CDCA3在肝癌中的作用，Real Time-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CDCA3在30例原發(fā)性肝癌組織中高表達，與前期高通量測序結(jié)果吻合[6]。但由于隨訪時間太短，本研究尚未確定CDCA3表達水平與患者生存時間的相關(guān)性。通過細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)下調(diào)CDCA3可以抑制肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進展。Hu等[18]發(fā)現(xiàn)CDCA3可能協(xié)同OY-TES-1共同參與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，與本研究結(jié)果相符。因此，本研究推測CDCA3可能是原發(fā)性肝癌的潛在生物標(biāo)志物。

根據(jù)最近的研究，CDCA3可以通過激活NF-κB/cyclin D1信號通路，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。CDCA3是否能通過NF-κB/cyclin D1信號通路影響肝癌細(xì)胞增殖，后續(xù)研究會進一步證實。當(dāng)然本研究也有不足之處：①只檢查了30例原發(fā)性肝癌的組織標(biāo)本，可能不具有代表性;②細(xì)胞系太過單一，應(yīng)選多株細(xì)胞進行實驗;③只是單從細(xì)胞水平進行了驗證，需要進一步行動物實驗來驗證CDCA3在原發(fā)性肝癌中的功能。總體而言，進一步的研究需要收集足夠的樣品，并且建立動物模型，探討CDCA3與NF-κB/cyclin D1信號通路的關(guān)系。

綜上所述，本研究提示，CDCA3可能是癌癥進展的關(guān)鍵分子，是預(yù)防和治療肝癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。

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（收稿日期：2019-11-26? 本文編輯：顧家毓）