王子逸儒，朱冬青，付金文，程寶乾，凌宗欣，陳楠

(1． 河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北醫(yī)科大學(xué) 臨床學(xué)院，河北 石家莊 050031；3．浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，附屬第一醫(yī)院,傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003)

研究發(fā)現(xiàn)引起KLA感染的高致病性K.pneumoniae菌多為K1或K2血清型[3-4]，該菌可能通過(guò)腸道異位引起KLA感染[5].本課題組研究發(fā)現(xiàn)K1型K.pneumoniae菌經(jīng)口灌胃后引起小鼠KLA感染，而非K1或K2型K.pneumoniae菌采用同樣的方法無(wú)法引起小鼠KLA感染[6]，并且K1型K.pneumoniae菌經(jīng)口灌胃后顯著改變了小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，包括Lactobacillus在內(nèi)的多個(gè)益生菌菌屬所占比例顯著下降[7].腸道菌群是抑制腸道外來(lái)病原菌入侵的重要屏障，而K1型K.pneumoniae菌所致腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與KLA感染的發(fā)生密切相關(guān).

糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是將健康供體糞便中的腸道菌群移植到受體的胃腸道內(nèi)從而改變受體腸道菌群組成，已被用于多種與腸道菌群紊亂相關(guān)的疾病治療中[8].FMT在腸道病原菌所致感染的治療中也取得了良好效果.研究報(bào)道FMT在腸道病原菌艱難梭菌所致感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)的臨床治療中取得了良好效果，尤其是對(duì)于復(fù)發(fā)難治型CDI感染，F(xiàn)MT治療效果優(yōu)于萬(wàn)古霉素等抗生素，顯著降低了嚴(yán)重CDI感染患者的死亡率[9].本研究采用小鼠KLA感染模型，旨在探討FMT對(duì)于高致病性K1型K.pneumoniae菌所致KLA感染的抑制作用，并對(duì)小鼠腸道菌群組成和腸道免疫防御分子進(jìn)行檢測(cè)分析，以明確其可能的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

成年雄性C57BL/6小鼠，5周齡，購(gòu)自北京維通利華公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，于實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；TRIzolTMReagen(Invitrogen，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Promega，美國(guó))；MUC2抗體和TNF-α抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))用于Western blot檢測(cè)；RIPA裂解液和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó))；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó))用于檢測(cè)胃腸黏液黏蛋白、防御素以及血清炎癥因子的濃度；其余均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析試劑或材料，腸道菌群測(cè)序由上海美吉生物有限公司完成.

全波長(zhǎng)Gen5酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，美國(guó))，7300Real Time PCR System(Applied Biosystems，美國(guó))，DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-25D型垂直電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳槽均購(gòu)自北京六一儀器廠.

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型與分組

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只，隨機(jī)分為3組：對(duì)照(Healthy)組、肺炎克雷伯菌(Kp)組、干預(yù)(FMT)組，每組10只.Kp組、FMT組經(jīng)口灌胃給予106CFU K1血清型K.pneumoniae菌懸液；FMT組在給予Kp菌24h后經(jīng)口灌胃0.3mL300mg/mL(活菌含量約為9.27×107CFU/mL)新鮮自制糞菌懸液，糞菌懸液來(lái)源于正常小鼠，參照文獻(xiàn)[10]的方法制備；相同條件下，Healthy組和Kp組灌胃等體積生理鹽水.于FMT處理24h后收集3組小鼠的血清、腸組織、胃腸黏液及盲腸內(nèi)容物.

1.2.2腸道菌群測(cè)序

學(xué)校需要更新辦學(xué)理念，在校企合作過(guò)程中最大程度地發(fā)揮企業(yè)的作用，通過(guò)企業(yè)掌握更多市場(chǎng)信息，進(jìn)一步調(diào)整專業(yè)結(jié)構(gòu)，改進(jìn)教學(xué)方法和評(píng)價(jià)方法，培養(yǎng)出更多更好的實(shí)用型和技能型人才。要改變目前校企合作中“學(xué)校熱、企業(yè)冷”的狀況，進(jìn)一步發(fā)揮政府統(tǒng)籌、協(xié)調(diào)作用，重視企業(yè)利益訴求，制定出有利于促進(jìn)校企合作的政策，建立起一套較為合理的校企合作利益分配機(jī)制、動(dòng)力驅(qū)動(dòng)機(jī)制、獎(jiǎng)勵(lì)激勵(lì)機(jī)制和溝通協(xié)調(diào)機(jī)制，使企業(yè)在校企合作中獲得利益。

將小鼠盲腸內(nèi)新鮮糞便放入無(wú)菌凍存管中立即置于液氮保存，隨后提取糞便樣品DNA，在Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行腸道菌群16S rRNA測(cè)序，序列遞交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)：PRJNA717064).使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)聚類并剔除嵌合體.對(duì)獲得OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，包括Alpha多樣性指數(shù)Shannon、Simpson、Ace和Chao，其中Shannon和Simpson指數(shù)反映微生物多樣性，Ace和Chao指數(shù)反映微生物豐度；采用主成分分析(principal coordinate analysis,PCoA)對(duì)β多樣性進(jìn)行分析，比較不同組間腸道菌群差異性；采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)對(duì)差異組分進(jìn)行分析.

1.2.3ELISA檢測(cè)血清炎癥因子和胃腸黏液免疫防御分子

眼球取血后，離心取上清液用于ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)濃度.取胃、腸內(nèi)容物于1.5mL無(wú)菌EP管中置于冰上，加等體積的無(wú)菌PBS，渦旋混勻，12000r/min4℃離心10min，取上清液用于ELISA檢測(cè)黏蛋白1(mucin1,MUC1)、MUC2和防御素分子濃度.依照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測(cè)樣品濃度.

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腸組織TNF-α、MUC2的mRNA表達(dá)

TRIzol法提取腸組織mRNA，檢測(cè)濃度后依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.以β-actin作為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)目的基因TNF-α、MUC2的mRNA表達(dá).

1.2.5 Western blot檢測(cè)腸組織TNF-α、MUC2蛋白表達(dá)

使用RIPA法提取腸組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌、一抗孵育過(guò)夜、洗滌、二抗室溫孵育、洗滌、顯影，以β-actin作為內(nèi)參，檢測(cè)目的蛋白TNF-α、MUC2蛋白表達(dá)情況.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FMT處理對(duì)小鼠KLA感染率和盲腸內(nèi)菌群整體結(jié)構(gòu)影響

在小鼠經(jīng)口灌胃K1型K.pneumoniae菌48 h后，與Kp組相比，F(xiàn)MT處理組小鼠KLA感染率顯著下降(P<0.05)(圖1a).在本課題組先前的研究中發(fā)現(xiàn)K1型K.pneumoniae經(jīng)口灌胃48 h后引起了約30%小鼠出現(xiàn)KLA病理改變，但所有小鼠的腸道菌群在K1型K.pneumoniae菌經(jīng)口灌胃后均發(fā)生了明顯改變[7].為了明確FMT處理小鼠是否改變了K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的小鼠菌群組成變化，隨機(jī)選取了Kp組和FMT處理組中未出現(xiàn)明顯病理改變的小鼠各5只與Healthy組一起進(jìn)行盲腸內(nèi)容物菌群16S rRNA高通量測(cè)序.

圖1 小鼠KLA感染率(a)和β多樣性PCoA分析(b)(*P<0.05)Fig.1 KLA infection rate in mice (a) and PCoA analysis for β diversity (b)(*P<0.05)

3組小鼠每組5只共獲得757 475條高質(zhì)量序列，對(duì)3組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析.α多樣性指數(shù)Shannon、Simpson、Ace和Chao在3組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1).β多樣性采用PCoA分析，結(jié)果表明3組之間存在明顯差異(P<0.05)(圖1b).

表1 3組小鼠腸道菌群α多樣性分析Tab.1 α diversity of intestinal microbiota in three group mice

2.2 FMT對(duì)K1型K.pneumoniae 菌所致小鼠菌群組成變化的影響

為了進(jìn)一步明確FMT處理對(duì)K1型K.pneumoniae菌所致小鼠菌群組分改變的影響，采用LEfSe對(duì)Kp組和FMT組小鼠菌群差異組分進(jìn)行進(jìn)一步的分析，且LDA(Linear discriminant analysis)評(píng)分相差2倍以上組分被列出(圖2).

a.LEfSe分析得出Kp組()和FMT組()小鼠腸道菌群主要差異組分；b.LDA評(píng)分大于2的菌群組分.圖2 Kp組和FMT組小鼠腸道菌群主要組分差異Fig.2 Taxonomic cladogram showed enriched taxa in Kp and FMT group

與Kp組相比，在門(mén)的水平上，F(xiàn)MT組Bacteroidetes豐度顯著增加；在科的水平上，F(xiàn)MT組Muribaculaceae和Rikenellaceae的豐度顯著增高(P<0.05)(圖3a-b).在屬的水平上，著重比較了2組中主要的菌屬(在總DNA序列占比>1%)差異.結(jié)果表明，與Kp組相比，F(xiàn)MT組中Lachnospiaceae_UCG_006、Alloprevotella、Alistipes和norank_f_Muribaculaceae菌屬豐度顯著增加，Akkermansia菌屬豐度顯著降低(P<0.05)(圖3c).

為了明確FMT處理是否完全恢復(fù)了K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的小鼠菌群失衡，比較了FMT組和Healthy組小鼠盲腸內(nèi)容物菌群組成差異.結(jié)果表明，2組在門(mén)水平豐度上沒(méi)有明顯差異.與Healthy組相比，在綱的水平上，F(xiàn)MT組Bacilli豐度明顯降低；在科的水平上，F(xiàn)MT組Rikenellaceae豐度明顯增加；在屬的水平上(在總DNA序列的菌屬占比>1%)，F(xiàn)MT組Ruminiclostridium_9、Bacteroides和Alistipes菌屬豐度明顯增加，同時(shí)Lactobacillus菌屬豐度顯著降低(P<0.05)(圖3d-f).

a,b,c.Kp組()和FMT組()在門(mén)、科和屬的水平上差異顯著的組分；d,e,f.FMT組()和Healthy組()在綱、科和屬的水平上差異顯著的組分(* P<0.05).圖3 在不同門(mén)類水平比較小鼠腸道菌群組分差異Fig.3 Comparison of the relative abundant bacterial sequences at the different levels

2.3 FMT對(duì)K1型K.pneumoniae 菌所致小鼠免疫防御因子改變的影響

本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)K1型K.pneumoniae菌灌胃后導(dǎo)致小鼠胃腸道免疫防御因子發(fā)生了明顯改變[11].為了進(jìn)一步明確FMT處理是否糾正了K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的小鼠胃腸道免疫防御因子改變，采用ELISA法比較了免疫防御因子的表達(dá)水平.結(jié)果顯示，與Kp組相比，F(xiàn)MT處理組小鼠血清TNF-α、腸防御素β-defensin 1和α-defensin 6、胃防御素β-defensin 1水平顯著下降(P<0.05)；同時(shí)腸黏蛋白MUC2水平顯著增高(P<0.05)(圖4).進(jìn)一步比較了腸組織TNF-α和MUC2 mRNA與蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與Kp組相比，F(xiàn)MT處理組TNF-αmRNA(圖5a)表達(dá)明顯下降(P<0.05)，同時(shí)TNF-α蛋白表達(dá)也下降(圖5b)；而MUC2mRNA(圖5c)表達(dá)顯著增高(P<0.05)，并且MUC2蛋白表達(dá)增多(圖5d).

a.血清免疫炎癥分子;b.胃、腸黏蛋白;c.腸防御素;d.胃防御素.*P<0.05.圖4 FMT處理對(duì)小鼠免疫防御分子水平的影響Fig.4 Effect of FMT treatment on levels of immune defense factors in mice

a.TNF-α mRNA;b.TNF-α蛋白;c.MUC2 mRNA;d.MUC2蛋白(*P<0.05).圖5 FMT處理對(duì)小鼠腸組織TNF-α、MUC2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of FMT treatment on the expression of TNF-α and MUC2 in intestine

3 討論

研究表明，F(xiàn)MT可以有效消除耐藥病原菌的腸道定植[12],且FMT也被用于腸道病原菌異位感染的臨床治療中.臨床病例報(bào)道，廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥K.pneumoniae菌株腸道異位后引起腎移植病人反復(fù)尿路感染，采用FMT治療取得了良好的效果[13].本研究也證實(shí)應(yīng)用FMT顯著降低了K1型K.pneumoniae菌腸道異位后引起的小鼠肝臟KLA感染率.

研究顯示,FMT通過(guò)有效恢復(fù)腸道菌群失衡從而達(dá)到治療疾病的目的[8].在CDI感染患者的FMT治療中，研究發(fā)現(xiàn)FMT處理1 d后患者腸道菌群顯著恢復(fù)且與正常腸道菌群組成最為相似[14].本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)K1型K.pneumoniae菌經(jīng)口灌胃后引起小鼠腸道菌群發(fā)生明顯改變[7].本研究也比較了FMT處理1 d后小鼠腸道菌群的改變情況.結(jié)果表明，F(xiàn)MT處理1 d后顯著改變了高致病性K1型K.pneumoniae菌所致小鼠腸道菌群組成的變化，明顯增加了Alloprevotella、Lachnospiraceae_UCG_006等菌屬的豐度.益生菌Alloprevotella已被證明可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，維護(hù)腸道菌群屏障[15-16].在阿霉素誘導(dǎo)的心臟中毒小鼠模型中，F(xiàn)MT處理后增加了Alloprevotella的豐度，改變了腸道菌群組成[17].Lachnospiraceae科細(xì)菌的代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)次生膽囊酸形成，維護(hù)腸道生理功能[18].在CDI小鼠感染模型中，F(xiàn)MT處理增加了Lachnospiraceae中細(xì)菌的豐度[19].另外，本研究顯示FMT處理1 d后小鼠腸道菌群未能完全恢復(fù)到正常小鼠腸道菌群組成，主要差異包括FMT處理組中Ruminiclostridium_9等菌屬的豐度顯著增高，Lactobacillus菌屬的豐度明顯降低.Ruminiclostridium_9是結(jié)腸腔內(nèi)重要的菌屬成員，可產(chǎn)生多酶復(fù)合物降解多糖，并且可以抑制炎癥反應(yīng)[20-21].本課題組先前研究顯示，KLA感染小鼠Lactobacillus菌屬豐度明顯降低[13]，本研究中FMT處理后Lactobacillus菌屬豐度未能恢復(fù)到正常小鼠水平.因此推測(cè)FMT對(duì)于K1型K.pneumoniae菌所致腸道菌群失衡的糾正可能主要是增加了Alloprevotella、Lachnospiraceae_UCG_006、Ruminiclostridium_9等優(yōu)勢(shì)益生菌屬的豐度，而與Lactobacillus菌屬無(wú)關(guān).

除腸道菌群外，腸腔表面的黏液層也參與了對(duì)外來(lái)病原菌的抵御作用.腸道黏液層包含有防御素、黏蛋白等成分，在防止致病菌入侵和維持腸道黏膜的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[22].本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)K1型K.pneumoniae菌經(jīng)口灌胃后導(dǎo)致胃腸道內(nèi)防御素分子濃度增高[11].在本研究中，F(xiàn)MT處理后顯著降低了K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的胃腸道防御素分子水平的增高.推測(cè)可能是FMT的應(yīng)用抑制了腸道內(nèi)K1型K.pneumoniae菌對(duì)于防御素的誘導(dǎo)刺激.在應(yīng)用FMT治療萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)感染小鼠的研究中，F(xiàn)MT處理后也顯著降低了防御素分子水平[23].MUC2是腸道主要的黏蛋白，與腸道菌群共同抵御外來(lái)的病原菌[24].潰瘍性結(jié)腸炎臨床病人MUC2蛋白合成下降且分泌減少[25].FMT處理增加了自閉癥模型小鼠腸道MUC2分子的表達(dá)[26].在本研究中FMT處理也增加了腸道MUC2分子的表達(dá).推測(cè)其可能機(jī)制是由于FMT處理引入了利用乳酸的Bacteroides細(xì)菌，這些細(xì)菌的生物代謝過(guò)程維持了腸腔內(nèi)pH值，從而促進(jìn)了黏蛋白的產(chǎn)生[27].此外，研究顯示FMT處理還改變了炎癥因子的水平.例如，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中，F(xiàn)MT顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平[28]；在肝性腦病大鼠模型中，F(xiàn)MT顯著降低了肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6等因子的水平[29].在本研究中，F(xiàn)MT處理后顯著降低了K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的TNF-α分子水平的增高.由此可見(jiàn)，胃腸道相關(guān)免疫因子也參與了FMT對(duì)K1型K.pneumoniae菌所致小鼠KLA感染的抑制作用.

綜上所述，F(xiàn)MT處理可以降低高致病性K1型K.pneumoniae菌導(dǎo)致的小鼠KLA感染，其機(jī)制可能與FMT糾正了K1型K.pneumoniae菌所致腸道菌群組成改變以及胃腸道免疫防御因子改變有關(guān).在目前抗生素應(yīng)用導(dǎo)致耐藥菌日益增多的情況下，F(xiàn)MT作為K1型K.pneumoniae菌所致KLA感染的新型治療方法具有一定的應(yīng)用前景和優(yōu)勢(shì).

致謝：感謝河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室博士后工作站對(duì)于本工作給予的幫助和支持.