李光芒

(陜西省藍田縣普化鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站, 陜西 藍田 710505)

流行性腹瀉是(porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由流行性腹瀉病毒(porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水為主要臨床癥狀的高度接觸性傳染病[1]。各年齡段的豬都可感染，斷奶仔豬和成年豬常發(fā)生一過性腹瀉，而7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬發(fā)生腹瀉并死亡，發(fā)病率高達100%,病死率平均為50%，且多數(shù)疫情發(fā)生在中小規(guī)模養(yǎng)豬場[2]。此外，該病具有季節(jié)性發(fā)病特點，我國流行性腹瀉多發(fā)于寒冷季節(jié)，以12月至次年2月為該病的高發(fā)期[3]。引起仔豬腹瀉的病因有很多，其中豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，除細菌性腹瀉之外，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病(PRoV)是較為常見的，可以引起仔豬腹瀉，而豬德爾塔冠狀病毒也是近期發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致仔豬腹瀉的新型冠狀病毒[4]。在我國豬病毒性腹瀉中，PEDV 的感染最為嚴(yán)重[5]。 PEDV 感染仔豬后可導(dǎo)致病豬出現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉、消瘦等臨床癥狀，且伴發(fā)高死亡率[6～7]。但由于其臨床癥狀與其它病毒性腹瀉類似，臨床和病理變化診斷無法確診，需要借助實驗室診斷技術(shù)對病因進行確診，以進行針對性地治療和防控。

仔豬一旦爆發(fā)腹瀉，引起仔豬成活率大大下降，生長緩慢，飼料報酬降低外，醫(yī)藥費用的投入也不斷增加。對此，細化規(guī)?；i場的飼養(yǎng)管理，有效及時預(yù)防產(chǎn)房仔豬腹瀉疾病是規(guī)?；i場節(jié)約成本，提高效益的方法。筆者就陜西某規(guī)?；i場2019年11月14日產(chǎn)房仔豬發(fā)生腹瀉的問題，將該場流行病調(diào)查、病理變化及實驗室的分子診斷結(jié)果相結(jié)合，最終確診為變異株感染的流行性腹瀉。經(jīng)過緊急處理措施后，疫情得到了控制，現(xiàn)將疾病的治療方案和臨床措施做一報道，以期為豬場流行性腹瀉的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2019年11月15日陜西省某規(guī)?；i場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸組織及內(nèi)容物，豬場采集分別采集小腸組織8份，糞便4份。

1.2 試劑與儀器

(1)試劑:核酸提取或淳化試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)；流行性腹瀉病毒經(jīng)典株和變異株雙重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬輪狀病毒實時熒光PCR檢測試劑盒、豬傳染性胃腸炎病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒均購自湖南圣湘生物科技有限公司。

(2)儀器:旋渦震蕩儀(Vorter-5)；高速冷凍離心機(Dlab-D3024R)；干式金屬浴鍋(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：JX-10)；旋渦儀(北京金泰宏達，型號：Mx-F)；超凈臺(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司，型號：CZA1812239)；小型離心機(北京金泰宏達，型號：Spin Plus)；熒光定量PCR儀(MYGo-PRO)；磁力架(24孔)。

1.3 病料處理

取500 mg的樣品進行反復(fù)凍融3次，且加入1 mL的滅菌生理鹽水于組織研磨器中充分研磨后置已高壓滅菌的1.5 mL的無酶EP管中，2 500 rpm·min-1離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中；糞便取1 g，加入1 mL生理鹽水，旋渦震蕩15 s，2 500 rpm·min-1離心5 min，將上清(靠近沉淀的上清)轉(zhuǎn)移至新的無酶離心管，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR檢測

(1)病毒RNA提取。取200 μL樣品上清于一個新RNA-free EP管，加入600 μL提取液1，旋渦震蕩10 s，在干式金屬浴鍋上95℃加熱10 min，瞬時離心。在每個樣品管添加100 μL提取液2和50 μL磁珠溶液，旋渦震蕩10 s，室溫靜置20 min。將樣品管瞬時離心后置于磁力架上，3 min后用移液器將溶液吸出(注意槍頭不能碰磁力側(cè)的磁珠)。每個樣品管加入600 μL提取溶液3和200 μL提取溶液4，震蕩混勻5 s，瞬離后將離心管再次置于磁力架上。約3 min后，用移液器將溶液緩慢吸出丟棄，靜置1 min后將管底殘余液體完全吸出丟棄。用30 μL洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，吸打混勻3～4次，室溫靜置10 min后將離心管再次置于磁性分離器上3 min，最后將洗脫下來的核酸放于新的1.5 mL離心管中。

(2)qPCR擴增。擴增體系體系為50 μL。反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄50℃30 min，預(yù)變性95℃ 1 min；95℃變性15 s，退火延伸60℃30 s，共40個循環(huán)；

反應(yīng)體系組分體系

RNA模板 5μL

PEDV酶混合液2μL

PEDV-反應(yīng)液 43μL

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

2019年11月14日，陜西省某基礎(chǔ)母豬存欄數(shù)約為1 200頭的規(guī)?；i場發(fā)生仔豬腹瀉，11月14日，產(chǎn)房2日齡個別仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀：嘔吐、扎堆、脫水并有嚴(yán)重漿糊樣腹瀉，11月15日產(chǎn)房7頭3日齡仔豬脫水、消瘦嚴(yán)重并死亡，且發(fā)病圈舍有個別母豬也出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象。11月17日疫情蔓延至妊娠舍、空懷舍及公豬舍。該豬場技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)病情后立即采取隔離、消毒、治療措施，直到該疫情解除，本次疫情一個月內(nèi)共死亡仔豬369頭仔豬。其中3日齡以內(nèi)出現(xiàn)腹瀉的有26窩，小計286頭乳豬，全部死亡淘汰；4～7日齡出現(xiàn)腹瀉有12窩，死亡75頭乳豬，死亡率63%；8～15日齡出現(xiàn)腹瀉癥狀的有57頭仔豬，其中8頭死亡，死亡率為14%；出現(xiàn)腹瀉癥狀的母豬及公豬經(jīng)過治療一周后恢復(fù)正常。

2.2 臨床癥狀及病理變化

(1)臨床癥狀。產(chǎn)房發(fā)病的乳豬表現(xiàn)癥狀為皮膚蒼白、被毛逆立、精神委頓、嘔吐、腹瀉、全身發(fā)抖、消瘦，發(fā)病初期糞便呈黃色水樣或糊狀，最后脫水、衰竭死亡(如圖1所示)。發(fā)病仔豬中個別表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，口吐白沫，角弓反張，四肢劃動呈游泳狀。死亡仔豬主要集中在5日齡以內(nèi)，而且初產(chǎn)母豬所產(chǎn)乳豬發(fā)病率較高。

(2)病理變化。發(fā)病乳豬表現(xiàn)精神沉郁，消瘦，皮膚黏膜蒼白，被毛粗亂，皮膚脫水；吮乳量減少，嘔吐、口吐白沫，排出水樣糞便，糞便呈黃色水樣或糊狀；部分乳豬四肢劃動呈游泳狀。病死豬尸體消瘦，皮膚干燥，呈典型脫水癥狀(圖1)；病理剖檢可見脾臟肉眼可見的病理變化，肺臟形成典型間質(zhì)性肺炎，腎臟表面有較明顯的淤血斑；胃容積增大、充滿內(nèi)容物，腸壁變薄，腸內(nèi)充滿黃色液體，胃腸道有豆花樣內(nèi)容物(圖2))；腸系膜充血。哺乳仔豬胃內(nèi)可見黃白色凝乳塊，小腸膨脹，腸壁變薄，腸腔內(nèi)充滿黃色稀薄的內(nèi)容物，腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)腫脹，切面濕潤多汁。

2.3 熒光定量PCR檢測

豬場熒光定量PCR檢測結(jié)果:對2019年11月14日從某規(guī)模化豬場采集的發(fā)病仔豬小腸組織8份及糞便4份，全部用于熒光定量PCR檢測，試驗結(jié)果如圖3、4、5顯示。被檢的12份樣品中一份為PEDV疫苗株陽性，其余11份均為PEDV變異株陽性。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Fam通道Ct值≦40且擴增曲線為典型S型，Hex通道無Ct值或典型的S型擴增曲線，報告為PEDV變異株陽性；Fam通道Ct值≦40，且均有S型擴增曲線，報告為PEDV經(jīng)典株陽性；Fam通道和Hex通道均無Ct值和S型標(biāo)準(zhǔn)曲線，報告為PEDV經(jīng)典株和疫苗株陰性。

根據(jù)上述實驗室熒光定量PCR檢測結(jié)果并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，臨床癥狀，病理變化分析，該豬場在2019年11月仔豬發(fā)生腹瀉性疾病的發(fā)生原因，確診為豬流行性腹瀉。

3 討論

1978 年，比利時首次分離鑒定出該病毒，命名為 CV777[8]。隨后，匈牙利、德國、泰國、韓國、日本、中國、美國等國家都陸續(xù)報道了本病。PEDV 造成的危害非常嚴(yán)重，2010-2011 年，我國有 100 多萬頭豬死于 PEDV[9]，2013 年美國暴發(fā)PEDV疫情，當(dāng)年美國損失了700 萬頭仔豬[10]。給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

筆者研究通過對某規(guī)模化豬場腹瀉仔豬進行流行病學(xué)調(diào)查，臨床癥狀、病理變化觀察以及實驗室熒光定量qPCR檢測的結(jié)果，將該豬場在2019年11月仔豬發(fā)生腹瀉性疾病的原因，確診為豬流行性腹瀉。

該豬場在發(fā)生仔豬腹瀉性疾病時，存在以下問題：①環(huán)境因素：產(chǎn)房衛(wèi)生條件差，保溫措施不理想，晝夜溫差大，加之入冬的突然降溫導(dǎo)致長期應(yīng)激仔豬的發(fā)病。②管理因素：該豬場仔豬發(fā)病前期有產(chǎn)房飼養(yǎng)員竄舍借用后備舍電源的情況，后備舍母豬之前存在拉稀現(xiàn)象，該行為應(yīng)該是仔豬腹瀉發(fā)生的直接誘因。③出生仔豬未能及時補充鐵硒等微量元素，導(dǎo)致仔豬抵抗力差，免疫系統(tǒng)脆弱。④生物防治因素：沒有做到全群免疫，所用疫苗質(zhì)量不好。

根據(jù)該規(guī)?；i場存在的問題，提出以下幾點緊急處理措施。發(fā)病產(chǎn)房所有人員進行隔離，并且嚴(yán)禁其他產(chǎn)房人員靠近發(fā)病產(chǎn)房；母豬普免2頭份腹瀉疫苗(后海穴注射)；腹瀉仔豬灌服5 mL硫酸慶大，并肌肉注射恩諾沙星2 mL；對產(chǎn)床下面及下水道拋灑火堿進行消毒，產(chǎn)床及保溫箱內(nèi)鋪灑密斯陀粉，并封閉下水道出口防止擴散；對脫水仔豬進行補液；對死亡仔豬進行采樣檢測；對傷亡嚴(yán)重的圈舍生火爐提高圈舍內(nèi)溫度。

母豬全群普免腹瀉苗，2周后執(zhí)行跟胎免疫方案，產(chǎn)前30 d活疫苗1頭份(后海穴注射)，產(chǎn)前10 d滅活苗4 mL(后海穴注射)；仔豬7日齡1頭份(活苗)后海穴注射，通過對比試驗進行效果評價；初生仔豬：吃初乳前，仔豬灌服1頭份活疫苗+2 mL腹瀉專用稀釋液+3 mL純牛奶，灌服2 min后吃初乳。通過對比試驗進行效果評價。此規(guī)?；i場在實施以上幾點防控措施20 d之后，仔豬腹瀉性疾病的發(fā)病率顯著下降，而且發(fā)生腹瀉的仔豬治愈率有所升高。