關(guān)于糧油檢驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線問題的探討

單非

摘 要：糧食中藥殘、金屬元素、添加劑、真菌毒素檢驗中涉及大量色譜、光譜分析方法，正確理解把握標(biāo)準(zhǔn)曲線是糧食檢驗的薄弱環(huán)節(jié)，根據(jù)日常檢驗實踐的積累，對工作中常見問題進(jìn)行探討和總結(jié)。

關(guān)鍵詞：糧油檢驗;標(biāo)準(zhǔn)曲線;制作;檢驗;使用

中圖分類號：TS210 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）06-0065-02

糧食質(zhì)量安全是糧食安全的重要組成部分，加強糧食質(zhì)量檢驗基礎(chǔ)工作和提高糧油檢驗員業(yè)務(wù)技術(shù)能力是行業(yè)發(fā)展的需要，是貫徹中國好糧油行動的具體體現(xiàn)。多年來，基層糧食檢驗機構(gòu)和企業(yè)對糧油的感官檢驗、物理檢驗和常規(guī)化學(xué)檢驗掌握較準(zhǔn)確，實踐積累多，而在藥殘、金屬元素、添加劑、真菌毒素等需使用色譜、光譜、質(zhì)譜類儀器上則存在儲多問題，“檢得慢、檢不出、檢不準(zhǔn)”等問題突出。尤其在標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、檢驗、運用上存在許多問題和誤區(qū)，直接導(dǎo)致檢驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，甚至嚴(yán)重失真。筆者總結(jié)多年來從事糧食檢驗的經(jīng)歷，就在糧油檢驗中使用標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)常見到和碰到的問題或者疑惑進(jìn)行粗淺的討論。

1糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的本質(zhì)

我們糧油分析檢驗的首要任務(wù)是定性和定量，定性可以說是有和無的問題，定量是提供待測物質(zhì)含量范圍的一個過程，這當(dāng)中包含了任何定性定量都有不確定度的含義。而普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線是糧食日常理化分析和檢驗中的日常性工作。糧油檢驗中的標(biāo)準(zhǔn)曲線可定義為：一系列已知含量（濃度）的物質(zhì)的量值與儀器響應(yīng)（儀器的峰高或峰面積）之間的關(guān)系，即一系列經(jīng)過確認(rèn)的濃度梯度在儀器上的信號反映。通過建立數(shù)學(xué)模型，處理后就得到方程，方程的圖形化表示就是我們所說的標(biāo)準(zhǔn)曲線。糧油檢驗中，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用是什么呢？就是使用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出被測物質(zhì)的含量（濃度）。我們在日常檢驗中通常是這樣做的，首先我們拿出一系列已知含量的物質(zhì)（或組分），進(jìn)樣后得到一組與含量對應(yīng)的儀器信號值，信號值與被測物的含量存在的對應(yīng)關(guān)系，就是一種函數(shù)關(guān)系。在數(shù)學(xué)上我們叫做曲線擬合，顯而易見，直線最簡單，因此，采用直線方程進(jìn)行擬合是我們最常用的一種方式。當(dāng)然，個別時候也用到多項式擬合等形式。

2糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.1糧油檢驗中常見錯誤做法

實際檢驗中，由于理論標(biāo)準(zhǔn)知識欠缺或操作不嚴(yán)謹(jǐn)，常出現(xiàn)以下情況：

（1）減少標(biāo)準(zhǔn)樣品點。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些檢驗員為實現(xiàn)相關(guān)系數(shù)R值合格或減小工作量，人為減少標(biāo)準(zhǔn)點;（2）被測量值已超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍仍使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者被測量值在曲線的低點（高點）時仍使用;（3）曲線相關(guān)系數(shù)R值不符合要求，照樣使用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的規(guī)則

那么，標(biāo)準(zhǔn)曲線到底應(yīng)該怎么做呢，是有明確標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》中進(jìn)行了以下基本原則的規(guī)定：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線都有一定的濃度范圍，被測物質(zhì)一般也有一定的測量范圍，一定要保證兩個范圍相互匹配，如不匹配，則需對標(biāo)準(zhǔn)濃度系列或被測物濃度進(jìn)行調(diào)整;（2）標(biāo)準(zhǔn)品與被測樣品在組分構(gòu)成上要盡量保持一致以減小干擾;（3）標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值盡量等距分布在曲線范圍內(nèi);（4）標(biāo)準(zhǔn)品的每個濃度點要至少重復(fù)2次，并且要從前處理（稀釋）開始;（5）標(biāo)準(zhǔn)樣品至少要有3個濃度梯度。

實際檢驗中，我們糧食國家方法標(biāo)準(zhǔn)中大部分列有標(biāo)準(zhǔn)濃度系列，盡量按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定去做。如果檢驗任務(wù)重或檢驗項目比較有把握時，想要適當(dāng)減少標(biāo)準(zhǔn)濃度點，則需要我們有理論的支持，同時最好有實踐的確證。無論如何，至少要有3個濃度梯度是最低標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)檢驗工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，主要是線性方程更為簡單。

3糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗

糧食標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗，是標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用很重要的一個方面，但同時也是我們糧油實際檢驗操作中不容易理解和掌握的地方，針對此問題的爭論也是最多的。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢驗：其實是校準(zhǔn)曲線的精密度檢驗。一般對于多個被測物濃度梯度所獲得的響應(yīng)峰高或峰面積值制作的校準(zhǔn)曲線，通常要求相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990，如果達(dá)不到此水平，則需要查找原因，并給予糾正，重新制作合格校準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性（精密度）檢驗，實際上真正含義就是：我們檢驗測得的若干個濃度點，在我們擬合成的直線方程上下左右的分布狀態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，數(shù)學(xué)上的原理是曲線上所有點以最小二乘法（OLS）擬合，曲線到所有點的垂直距離的和為最小。通過原理可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線在實際上不是必須通過全部濃度點，而是從總體上更接近全部濃度點。因此，線性檢驗實際上就是看這些測試點與擬合直線的距離，確認(rèn)是否出現(xiàn)了異常狀態(tài)。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距檢驗：這是一種校準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度的檢驗。線性檢驗如果合格，則對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，從而取得回歸方程y=a+bx，然后進(jìn)行相應(yīng)t檢驗。一般取95%置信水平，如無顯著性差異，則a可做0處理，方程簡化為y=bx，即x=y/b。通過簡化處理后，在一定方程線性范圍內(nèi)，我們可以用此方程直接替代校準(zhǔn)曲線。這種情況下，樣品測量的峰高或者峰面積值經(jīng)校正空白后，就可以直接計算出試樣濃度。如果存在顯著性差異，則是表明所得曲線的回歸方程準(zhǔn)確度不是很高。這時，要找出原因予以校正。

無論何時，我們所得曲線方程不經(jīng)過以上的檢驗和相應(yīng)校正，直接用于我們檢驗結(jié)果的計算，必將給測定結(jié)果帶來偏差，甚至嚴(yán)重影響結(jié)果的可信度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率檢驗：這其實是對分析方法靈敏度的檢驗。我們知道，分析方法的靈敏度和實驗條件是相關(guān)的，會隨著實驗條件的變化而變化。如果在完全相同的分析實驗條件下，只是隨機誤差導(dǎo)致的斜率變化，一般不會超出一定范圍，這個范圍只是由于分析方法的精度不同造成的。例如，糧食重金屬檢驗中原子吸收分光光度法國家標(biāo)準(zhǔn)一般要求結(jié)果相對差值小于10%等。

4糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線常見問題的探討

4.1每次實驗是否都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線

無論色譜還是光譜類儀器，由于每天所配的流動相都會有所不同，檢測器能量也在不斷的衰弱過程中，會導(dǎo)致出峰時間、峰面積等相應(yīng)都有所差異。因此，條件允許情況下，建議每次均做標(biāo)準(zhǔn)曲線。特別是現(xiàn)在儀器均配備多位數(shù)自動進(jìn)樣系統(tǒng)，節(jié)省時間和人力，檢驗人員能夠承受此工作量。

如果檢測項目屬于長期連續(xù)檢測，儀器狀態(tài)穩(wěn)定，可以采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定位與定量的方式進(jìn)行曲線確認(rèn)。比如在樣品鉛檢測分析時，可在實驗時選擇測定兩個標(biāo)準(zhǔn)濃度點（如5?g/L，20?g/L），若測得兩個標(biāo)準(zhǔn)濃度點的響應(yīng)值與原標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)點的相對偏差均小于5%時，那么原校準(zhǔn)曲線仍可使用?；蛘卟捎妹颗鷺悠窚y定一個校準(zhǔn)曲線中間點濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，其測定濃度與校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點的濃度相對誤差不超過規(guī)定范圍也可。特別需注意的是，檢測項目不同，分析測試方法不同，校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性是不同的，采用上述方法的前提中校準(zhǔn)曲線的斜率較為穩(wěn)定。

4.2曲線相關(guān)系數(shù)有效數(shù)字保留問題

國家標(biāo)準(zhǔn)GB5750.3-20068.2.7項規(guī)定如下：相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點后出現(xiàn)非9的一位，如0.999987→0.99998。如果小數(shù)點后出現(xiàn)許多位9時，最多保留小數(shù)點后4位，即0.9999。

4.3糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線是否必須過原點

標(biāo)準(zhǔn)曲線不一定非要過原點，只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。從原點（0，0）代表的意義來考慮，即所測組分濃度為零的時候，信號響應(yīng)值（峰高或峰面積）是否也為零。理論上色譜分析可以，而光譜分析就講不通了，濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液（本底）響應(yīng)信號（吸光度）往往不是零。

4.4檢驗中空白測出負(fù)值怎么辦

空白的意義，是代表我們實驗中選擇的空白（試劑、器皿等）對儀器響應(yīng)/信號的影響，有此時候是正方向的，也可能是負(fù)方向的，從理論上講，必須減掉空白。

4.5濃度法還是體積法進(jìn)樣哪個更適合糧食檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線

一般我們制作標(biāo)準(zhǔn)系列時，是配制不同濃度，進(jìn)樣相同體積，大部分糧食國家方法標(biāo)準(zhǔn)也采用此法，這即是濃度法進(jìn)樣。個別時候，也可能會用到同一濃度不同體積來進(jìn)樣，稱為體積法進(jìn)樣，并不太常見。濃度法進(jìn)樣時溶劑的環(huán)境（體積）是一致的，可以想像這樣在判斷溶劑（或溶劑中干擾物質(zhì)）和被測物質(zhì)更加容易，更好確認(rèn)。體積法進(jìn)樣中我們可以想到，干擾物質(zhì)可能會隨標(biāo)準(zhǔn)系列的變化而變化，實現(xiàn)待測物質(zhì)的確認(rèn)就會受到干擾。還有一點就是小體積進(jìn)樣時不確定度會較大。因此，與濃度法進(jìn)樣相比，體積法要得到理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能會更難，做不好，對結(jié)果的影響是巨大的。另外還有一個問題，就時進(jìn)樣系統(tǒng)物理體積的限制問題，較大跨度的濃度系列使用體積法進(jìn)樣是不太容易實現(xiàn)的。通過兩種進(jìn)樣方式的比較論述可以看出，濃度法進(jìn)樣具有更多優(yōu)點，比如更容易做出理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線，更容易實現(xiàn)較大濃度跨度的進(jìn)樣，更容易實現(xiàn)待測物質(zhì)的確認(rèn)等?；跐舛冗M(jìn)樣法的以上優(yōu)勢，我們糧油檢驗標(biāo)準(zhǔn)曲線制作還是建議使用濃度進(jìn)樣法。

4.6樣品是負(fù)值時，結(jié)果怎么確定

日常檢驗中，經(jīng)常會出現(xiàn)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品檢測為負(fù)值的情況，我們一般選擇這樣幾種方式確認(rèn)和報告結(jié)果：未檢出，低于檢出限，低于定量限，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點的樣品濃度。一般來說，以上幾種確認(rèn)和報告結(jié)果的方式都可以采用，實際區(qū)別是四種選擇下面的風(fēng)險是不一樣的。

報告未檢出時，要加入界定語描述，如“本實驗室、本儀器、本方法未檢出”等。如果不體現(xiàn)這些具體的界定語描述，僅“未檢出”的結(jié)果報出，歧義就很大很多。

檢出限（LOD）是我們進(jìn)行某種組分檢測時定性檢出的標(biāo)志，它一般是和空白統(tǒng)計比較后，計算出來的。通常檢出限用基質(zhì)空白所產(chǎn)生的儀器背景信號的3倍值的相應(yīng)量，或者以基質(zhì)空白產(chǎn)生的背景信號平均值加上3倍的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差來確定。

定量限（LQD）是可以定量檢出的標(biāo)志，其RSD定為10%，定義為樣品中被測物能被定量測定的最低量，現(xiàn)實檢驗中要求其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度。定量限的意義主要是體現(xiàn)了實驗分析方法是否具有較好的定量檢測能力。

標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點的樣品濃度值，可以理解為是我們比較可信的儀器測定值。低于第一點的樣品濃度值，則其可信度就會有疑問，值得懷疑。

總之，報告“低于檢出限，低于定量限，低于標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點的樣品濃度”，風(fēng)險依次降低。如果國標(biāo)方法中明確了檢出限或定量限，推薦直接報告小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限值。

正確理解和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，是當(dāng)前糧油檢驗專業(yè)技術(shù)人員開展檢驗工作的基礎(chǔ)。隨著糧食檢驗由簡單的物理檢驗向成分分析、污染物監(jiān)測、添加劑的檢驗、新產(chǎn)品開發(fā)等領(lǐng)域的拓展，標(biāo)準(zhǔn)曲線的應(yīng)用越來越普及。因此，根據(jù)日常檢驗實際，做以探討交流。