姚 銳， 任學軍， 李明昊， 楊夢涵， 郭振清， 高 慧， 林小虎

(河北科技師范學院農學與生物科技學院， 河北 秦皇島 066004)

麥類作物作為禾本科作物中基因組多倍化較為復雜的一個類群，它們在多倍性進化過程中極易發(fā)生染色體重排，廣泛的染色體重排增加了基因組的不穩(wěn)定性，導致了新核型和子代新物種的形成[1]。隨著“中國春”小麥基因組測序完成及其近緣物種(粗山羊草、二穗短柄草等)基因組草圖的公布，利用比較基因組學方法研究小麥基因組序列組裝、染色體結構變異受到許多學者的關注。馬建等[2]鑒定了“中國春”小麥4 A、5 A 和7 B易位染色體上參與易位和倒位片段的斷點側翼基因序列；Wang等[3]揭示了小麥、大麥、粗山羊草和短柄草基因組獨立的重組關系；孫桑蓉[4]明確了全基因組加倍對于麥類基因家族擴增有著重要作用，并通過生物信息學方法進行了基因組結構解析和多倍化過程的重構。麥類作物基因組草圖測序工作的完成為闡明麥類作物基因組的多倍性進化歷程起到推動作用，但染色體核型分析在近緣多倍性物種進化關系分析中依然具有重要的理論和現實意義[5-6]。

黑麥屬(SecaleL.)是小麥的三級基因源，具有抗白粉病、抗三銹病、抗旱、抗寒等優(yōu)良性狀[7-8]。為了將黑麥中的有益基因轉移到小麥中，育種家利用遠緣雜交等手段創(chuàng)制了一批小麥-黑麥雙二倍體、非整倍體。其中六倍體小黑麥和八倍體小黑麥作為創(chuàng)造小麥-黑麥異附加系、異代換系、異易位系的重要材料，在育種工作中具有重要地位[9]。六倍體小黑麥(AABBRR,2 n=42)由四倍體小麥(T.turgidum, AABB,2 n=28)或普通小麥(TriticumaetivumL. AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥(SecalecerealL. RR,2 n=14)遠緣雜交、人工染色體加倍獲得，八倍體小黑麥(AABBDDRR,2 n=56)是由普通小麥(TriticumaetivumL. AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥遠緣雜交、人工染色體加倍獲得。關于二倍體黑麥和六倍體小黑麥的核型已有相關報道，普遍認為二倍體黑麥有14條染色體，但不同品種及生境的二倍體黑麥染色體核型類型不盡相同[10-12]；六倍體小黑麥有42條染色體，武晶研究得出的核型分析結果為2 n=42=30 m(2 SAT)+2 M+8 sm+2 st(2 SAT)[13]，然而尚未見八倍體小黑麥的核型報道。本研究首次報道了八倍體小黑麥的核型，豐富了小黑麥的細胞遺傳學研究，并且將八倍體小黑麥與二倍體黑麥、六倍體小黑麥的核型進行了進化趨勢分析，旨在為3個物種的染色體組學研究和相關的麥類作物育種提供細胞學基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料二倍體黑麥(SecalecerealL.)為荊州黑麥；六倍體小黑麥(×TriticalehexaploideL.)由山東農業(yè)大學自墨西哥國際玉米小麥改良中心引進；八倍體小黑麥(×TriticaleoctoploidL.)由南京農業(yè)大學亓增軍教授以荊州黑麥和普通小麥輝縣紅創(chuàng)制，山東農業(yè)大學引進。上述材料均由山東農業(yè)大學農學院國家小麥改良中心泰安分中心王洪剛教授課題組提供。

1.2 方 法

1.2.1實驗方法

將3種供試材料種子置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中室溫浸種至露白，移置于濕潤的濾紙上室溫培養(yǎng)，待根長至1～2 cm時，剪取根尖放入EP管中，冰水浴36 h。用卡諾固定液(乙醇∶冰醋酸體積比3∶1)固定2 d。蒸餾水漂洗后于1 mol·L-1HCl溶液中60 ℃解離8 min，蒸餾水漂洗10 min，改良卡寶品紅染液染色2 min，壓片并在OLYMPUS BX 53型顯微鏡下鏡檢，統(tǒng)計各細胞染色體數目，選取染色體分散良好的細胞拍照。采用Photoshop CS 6軟件分析圖像[14]，并用Excel軟件處理數據。

1.2.2染色體核型分析方法及進化指數賦值方法

每個物種選取5個染色體處于有絲分裂中期且分散良好的細胞，參照李懋學等[15]的染色體核型方法計算核型數值。核型類型參照Stebbins[16]的標準。核型不對稱系數參照Arano[17]的方法計算。染色體相對長度比、平均臂比、不對稱系數、臂比大于1.7的染色體比例采用分支系統(tǒng)學的常規(guī)編序、賦值方法進行賦值[18]，最終求得可以反映每個物種進化程度的進化指數。具體賦值方法如下：

1) 染色體長度比越大，核型越傾向于不對稱。3個物種的染色體長度比可粗略分為4個進化階段，即1.00以下(賦值為0)→1.00～1.50(賦值為1)→1.51～2.00(賦值為2)→2.01及以上(賦值為3)。

2) 平均臂比值越大，核型越顯不對稱。3個物種的染色體平均臂比值分為4個階段，即1.70以下(賦值為0)→1.70～1.90(賦值為1)→1.91～2.10(賦值為2)→2.11及以上(賦值為3)。

3) 臂比大于1.7的染色體比例越大，核型越顯不對稱。3個物種的染色體臂比大于1.7的染色體比例分為4個進化階段，即0.20及以下(賦值為0)→0.21～0.40(賦值為1)→0.41～0.60(賦值為2)→0.61及以上(賦值為3)。

4) 不對稱系數偏大，核型也顯示不對稱。3個物種染色體不對稱系數分為4個進化階段，即60以下(賦值為0)→60～62(賦值為1)→62～64(賦值為2)→64以上(賦值為3)。

注：A為二倍體黑麥染色體形態(tài)；B為六倍體小黑麥染色體形態(tài)；C為八倍體小黑麥染色體形態(tài)；D為二倍體黑麥染色體核型；E為六倍體小黑麥染色體核型；F為八倍體小黑麥染色體核型。標尺200 μm。

2 結果與分析

本實驗共測量分析麥類作物含R基因組3個物種的核型，根尖細胞染色體形態(tài)、核型見圖1，染色體核型參數及進化指數見表1和表2。

二倍體黑麥染色體相對長度范圍為10.36%～16.92%，最長和最短的染色體比值為1.63，臂比大于2∶1的染色體為0對，應屬于“1 A”型。核型不對稱系數為58.08%，屬于較為對稱類型。第3、6對染色體為近中部著絲點染色體，其余為中間著絲點染色體，1染色體帶有隨體，其核型公式為2 n=2 x=14=10 m+4 sm+(2 SAT)(表1)。

六倍體小黑麥染色體相對長度范圍為3.50%～6.02%，最長和最短的染色體比值為1.72，臂比大于2∶1的染色體為2對，應屬于“2 A”型。核型不對稱系數為57.91%，屬于較為對稱類型。第12對為正中部著絲點染色體，第3、11、15對染色體為近中部著絲點染色體，其余為中部著絲點染色體，其核型公式為2 n=6 x=42=2 M+34 m+6 sm(表1)。

八倍體小黑麥染色體相對長度范圍為2.45%～4.62%，最長和最短的染色體比值為1.89，臂比大于2∶1的染色體為1對，應屬于“2 A”型。核型不對稱系數為56.44%，屬于較為對稱類型。第15、23、25對染色體為正中部著絲點染色體，第14、24、26對染色體為近中部著絲點染色體，其余為中部著絲點染色體，其核型公式為2 n=8 x=56=6 M+44 m+6 sm(表1)。

依據Stebbins提出的核型進化理論，核型進化是由對稱向不對稱方向發(fā)展的[13]。核型參數可以反映每個物種發(fā)育的進化程度，從而可以反映各自的進化水平。核型為1 A的二倍體黑麥進化程度較為原始，核型為2 A的六倍體小黑麥和八倍體小黑麥進化程度相對較高。由表2可知，二倍體黑麥、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥進化指數分別為3、4、4，表明六倍體小黑麥和八倍體小黑麥進化程度相同且高于二倍體黑麥的進化水平。

3 討 論

本研究的2種小黑麥是由四倍體小麥(AABB,2 n=28)或普通小麥(AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥(RR,2 n=14)雜交培育獲得的雙二倍體，帶有親本A、B、(D)、R基因組。研究表明，小麥族B基因組中，1 B、6 B染色體帶有隨體[19]；二倍體黑麥1 R染色體帶有隨體[10]，但也有不同觀點，代明等[12]、Gill[20]的研究指出，有些黑麥染色體不帶有隨體，不同居群、生境、品種的黑麥染色體核型存在差別。小黑麥是人工合成的作物，含有親本2個不同物種的染色體，染色體遺傳機制較為復雜，理論上六倍體小黑麥和八倍體小黑麥都應該有6條染色體帶有隨體。然而，2種小黑麥根尖細胞觀察結果顯示，沒有帶6條隨體染色體的細胞出現。在部分六倍體小黑麥根尖細胞中，觀察到帶1條隨體染色體的情況，說明本試驗所采用的六倍體小黑麥材料，至少應該有2條染色體帶有隨體；在部分八倍體小黑麥根尖細胞中，觀察到帶有1條隨體、2條隨體、3條隨體染色體的情況，說明本實驗所采用的八倍體小黑麥材料可能有4條或6條染色體帶有隨體。在武晶[13]的研究中，由四倍體硬粒小麥和二倍體黑麥培育的六倍體小黑麥Occurance 54-22核型公式為2 n=42=30 m(2 SAT)+2 M+8 sm+2 st(2 SAT)，含有普通小麥A、B基因組和黑麥R基因組，其中4條染色體帶有隨體，與理論上的6條帶隨體染色體數目不符。在本研究中，2種小黑麥材料體細胞中同樣未見與理論相符的帶隨體的染色體數目。

表1 麥類作物含R基因組3個物種染色體參數

種名染色體編號相對長度/%臂比類型二倍體黑麥(Secale cereal L.)18.75+8.17=16.921.07m29.03+6.46=15.491.40m39.89+5.51=15.401.79sm48.46+6.84=15.301.23m57.79+7.13=14.921.09m67.70+3.90=11.601.98sm*76.46+3.90=10.361.66m六倍體小黑麥(×Triticale hexaploide L.)13.13+2.89=6.021.08m23.27+2.43=5.701.35m33.55+2.01=5.561.77sm43.08+2.43=5.521.27m53.08+2.38=5.461.29m63.22+2.19=5.411.47m72.94+2.33=5.271.26m82.61+2.52=5.131.04m93.08+1.91=4.991.61m102.94+2.01=4.951.47m113.17+1.59=4.762.00sm122.33+2.33=4.661.00M132.85+1.77=4.621.61m142.85+1.77=4.621.61m152.99+1.49=4.482.00sm162.24+2.01=4.251.12m172.33+1.68=4.011.39m182.05+1.77=3.821.16m192.10+1.68=3.781.25m202.01+1.49=3.501.34m212.10+1.40=3.501.50m種名染色體編號相對長度/%臂比類型八倍體小黑麥(×Triticale octoploid L.)12.54+2.08=4.621.23m22.54+2.08=4.621.23m32.41+1.84=4.251.31m42.41+1.81=4.221.33m52.28+1.91=4.191.19m62.41+1.74=4.151.38m72.34+1.74=4.081.35m82.34+1.67=4.011.40m92.04+1.94=3.981.05m102.28+1.61=3.891.42m112.04+1.84=3.881.11m122.04+1.71=3.751.20m132.28+1.41=3.691.62m142.48+1.21=3.692.06sm151.84+1.84=3.681.00M161.98+1.67=3.651.18m171.94+1.67=3.611.16m181.84+1.54=3.381.20m191.87+1.44=3.311.30m201.91+1.41=3.321.36m211.74+1.41=3.151.24m221.81+1.27=3.081.42m231.41+1.41=2.821.00M241.81+1.00=2.811.80sm251.34+1.34=2.681.00M261.64+0.94=2.581.75sm271.47+1.00=2.471.47m281.41+1.04=2.451.35m

注：M、m、sm、*分別表示正中部著絲點染色體、中部著絲點染色體、近中部著絲點染色體、隨體，隨體長度未計算在內。

表2 麥類作物含R基因組3個物種染色體重要性狀及編碼

種名核型公式染色體長度比平均臂比臂比大于1.7的比例不對稱系數/%進化指數核型類型二倍體黑麥(Secale cereal L.)2n=2x=14=10m+4sm(2SAT)1.63(2*)1.46(0*)28.57(1*)58.08(0*)3*1A六倍體小黑麥(×Triticale hexaploide L.)2n=6x=42=2M+34m++6sm1.72(2*)1.41(0*)42.86(2*)57.91(0*)4*2A八倍體小黑麥(×Triticale octoploid L.)2n=8x=56=6M+44m+6sm1.89(2*)1.32(0*)42.86(2*)56.44(0*)4*2A

注：“*”為性狀狀態(tài)編碼數值。

目前，關于植物細胞隨體染色體的研究不夠深入，隨體的遺傳機制尚不明確。在禾本科植物中，普遍認為水稻有2對帶隨體染色體，然而不同品種、不同生境的水稻有1對、2對、3對隨體染色體的報道[21,22]，尚未發(fā)現相關的研究成果對這一現象進行解釋，可能是因為染色體隨體伸長或者隨體染色體的NOR活性不同引起的淡化導致的假象。另外，依據穆爾(莫慧英譯)提出的理論，也可能是因為核仁合并或者親本中一個種的核仁中心對另一個種呈顯性導致隨體消失[23]。此外，Li等[24]研究發(fā)現，二倍體小麥和黑麥在4 L上有相同的染色體重排斷點，5 L上的染色體重排斷點位置大體相近，表明小黑麥在進化過程中極有可能在4 L5 L處發(fā)生相應的異位，這些變化都可能引起同源共線性基因片段的變化或基因組的重排，從而發(fā)生染色體片段的倒位、重復、插入和缺失等現象，進而影響染色體間的重組，最終導致麥類作物多倍性進化歷程中核型的變化。

在本研究中，二倍體黑麥核型公式為2 n=2 x=14=10 m+4 sm(2 SAT)，核型類型為1 A，進化指數為3；六倍體小黑麥核型公式為2 n=6 x=42=2 M+34 m+6 sm，核型類型為2 A，進化指數為4；八倍體小黑麥核型公式為2 n=8 x=56=6 M+44 m+6 sm，核型類型為2 A，進化指數為4，六倍體小黑麥和八倍體小黑麥核型進化程度高于二倍體黑麥。由于小黑麥具有親本2個不同物種的全套基因，可以利用2個基因庫的基因來抵擋環(huán)境的變化，在進化層面上，小黑麥應該進化程度更高，在農藝生產中，小黑麥確實兼具黑麥和小麥的優(yōu)良性狀[25]，核型分析得出的結論也驗證了這一點。