葉阿里，鄒雨桐，張海燕，吳 潔，張 睿，張曉峰，馬慶偉

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 北京 100730； 2.北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司， 北京 102206)

他汀類藥物(statins)是臨床常用的調(diào)脂藥物之一，也是預(yù)防心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的首選用藥[1]。然而，他汀類藥物的治療效果和臨床適用性存在明顯的個(gè)體差異，他汀相關(guān)性肌病(statin-associated muscle symptoms，SAMS)是最普遍的他汀藥物不良反應(yīng)[2]。SLCO1B1編碼有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP1B1)，主要定位于人類肝細(xì)胞膜上，介導(dǎo)他汀類藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]，研究表明SLCO1B1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism，SNP)，rs2306283(388A>G)和rs4149056(521T>C) 與SAMS密切相關(guān)[4]。另一個(gè)與他汀藥物療效相關(guān)的基因是ApoE，其表達(dá)產(chǎn)物載脂蛋白E通過與LDL受體結(jié)合，調(diào)控膽固醇和其他脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。ApoE的SNP位點(diǎn)rs429358(388T>C)和rs7412 (526C>T)，可構(gòu)成ε3(388T-526C), ε2(388T-526T)和ε4(388C-526C) 3種單倍體，及6種基因型：ε2ε2、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε3、ε3ε4、ε4ε4。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測SLCO1B1和ApoE多態(tài)性的技術(shù)，然而該方法僅適用于個(gè)別SNP位點(diǎn)的檢測。近年來，核酸質(zhì)譜技術(shù)在基因組學(xué)領(lǐng)域得到了飛速發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)因其可同時(shí)完成多個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測，準(zhǔn)確性高、成本較低等優(yōu)勢已逐漸成為SNP分析的新方法。本研究通過對MALDI-TOF-MS和RT-qPCR兩種技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)比對，評價(jià)MALDI-TOF-MS是否能應(yīng)用于臨床脂質(zhì)和藥物代謝相關(guān)基因的檢測，從而指導(dǎo)臨床他汀類藥物的使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：選取2018年7月至2018年9月在北京協(xié)和醫(yī)院就診，臨床診斷為高脂血癥、高血壓或動脈粥樣硬化的患者71例，其中男性32例，女性39例。收取其常規(guī)檢測后剩余無污染的EDTA抗凝外周血標(biāo)本，用于后續(xù)基因組DNA提取和基因多態(tài)性檢測。納入者的基本信息和生化檢測結(jié)果由北京協(xié)和醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)獲取，整個(gè)分析過程進(jìn)行隱私化處理。此研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：S-K1108)，并免除知情同意。

1.1.2 試劑及試劑盒：MALDI-TOF-MS(Clin-TOF Ⅱ)配套高血脂相關(guān)基因檢測試劑盒(微陣列芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜法)、軟件分析系統(tǒng)(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)；飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)核酸樣本純化試劑(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，京經(jīng)械備20190095號)；人SLCO1B1和ApoE多態(tài)性檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司，國械注準(zhǔn)20153400245)；全血基因組DNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提?。喝?00 μL EDTA-K2抗凝外周血，使用NP968全自動核酸提取儀及配套天隆全血提取試劑盒，按照說明書操作提取基因組DNA，使用Thermo MultiskanGO核酸分析儀測定提取DNA的濃度和純度，取濃度在5 mg/L～200 mg/L，A260/280在1.7～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置-20 ℃保存。

1.2.2 MALDI-TOF-MS檢測SLCO1B1和ApoE多態(tài)性：PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增體系包括1 μL基因組DNA、0.2 μL PCR酶、1 μL PCR緩沖液、1 μL擴(kuò)增引物和1.8 μL增效劑，擴(kuò)增條件為50 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min， 45個(gè)循環(huán)后72 ℃持續(xù)5 min。SAP酶消化：將蝦堿性磷酸酶0.5 μL及其反應(yīng)液1.5 μL加入上一步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，37 ℃保溫30 min后，65 ℃保溫5 min。單堿基延伸：在SAP酶消化后的產(chǎn)物中加入延伸反應(yīng)混合物，包括0.23 μL延伸酶、0.83 μL反應(yīng)液和0.94 μL延伸引物，進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，56 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，內(nèi)部5個(gè)循環(huán)，持續(xù)外部40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。MALDI-TOF-MS檢測：延伸反應(yīng)完畢后，向每PCR管/孔延伸產(chǎn)物中加入41 μL超純水和15 mg飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)核酸樣本純化試劑，顛倒混勻5 min完成脫鹽，5 000 r/min離心1 min。取經(jīng)過脫鹽處理的樣品點(diǎn)在樣品靶上使之自然結(jié)晶；而后，通過MALDI-TOF-MS(Clin-TOF II)進(jìn)行檢測，MALDI-TOF-MS采用的是樣品與基質(zhì)混合進(jìn)樣，激光解析方式電離以及飛行時(shí)間方法進(jìn)行質(zhì)量分析。樣本檢測結(jié)果由配套分析軟件檢測質(zhì)譜峰并判讀所檢測基因位點(diǎn)的基因型。

1.2.3 RT-qPCR檢測SLCO1B1和ApoE多態(tài)性：用人SLCO1B1和ApoE多態(tài)性檢測試劑盒，按照試劑盒操作說明要求配制PCR體系。簡單來說，試劑盒中包括4種反應(yīng)液，分別針對SLCO1B1 rs2306283 (388A>G)、rs4149056(521T>C)和ApoE rs429358(388T>C)、rs7412(526C>T) 4個(gè)基因位點(diǎn)，每人份需配置4個(gè)反應(yīng)體系，將4種反應(yīng)液分裝到PCR管中，23 μL/管，再加入2 μL基因組DNA模板。在Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成這4個(gè)基因位點(diǎn)的檢測。PCR反應(yīng)條件為：37 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。檢測結(jié)果通過使用“Endpoint Genotyping”(終點(diǎn)基因分型)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基因與基因型分布

71例患者包括男性32例，平均年齡為(57±13)歲，女性39例，平均年齡為(64±9)歲。分別用RT-qPCR和MALDI-TOF-MS對這71例患者的SLCO1B1 rs2306283 (388A>G)、rs4149056 (521T>C)和ApoErs429358 (388T>C)、rs7412 (526C>T) 4個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(圖1，2)。

2.2 兩種方法檢測SLCO1B1和ApoE的基因型結(jié)果的一致性(表1，2)

3 討論

作為治療脂代謝紊亂的一線藥物，他汀類藥物雖具有很好的降脂作用，但其所產(chǎn)生的包括他汀相關(guān)性肌病在內(nèi)的副作用及治療效果的個(gè)體差異已成為困擾臨床用藥的難題，這種差異被證實(shí)與基因多態(tài)性密切相關(guān)[5]。SLCO1B1 rs4149056(521T>C)和rs2306283(388A>G)多態(tài)性，ApoErs429358(388T>C)和rs7412(526C>T)多態(tài)性是種族多樣化人群中普遍發(fā)生的變異，許多體外和臨床研究已經(jīng)評估了這些變異對個(gè)體藥物配置和反應(yīng)差異的影響[6-7]。

本研究中SLCO1B1 388A>G位點(diǎn)的基因型分布為AA(4.32%)C位點(diǎn)的基因型分布為TT(76.06%)>TC(23.94%)>CC(0%)。SLCO1B1 521T>C位點(diǎn)較388A>G位點(diǎn)更為重要，對于每天使用80 mg辛伐他汀藥物治療的患者，SLCO1B1 c.521 TC基因型發(fā)生肌病風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的4.5倍， CC基因型發(fā)生肌病風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的16.9倍[8]。此外，本研究結(jié)果表明ApoE的6種基因型中，ε3/ε3分布頻率最高，ε3/ε4和ε2/ε3居中，ε4/ε4、ε2/ε4和ε2/ε2 三者發(fā)生頻率最低，ε3等位基因頻率(83.8%)遠(yuǎn)超過其余兩種單倍體型別，該結(jié)果符合已有研究報(bào)道不同人群中的高ε3等位基因頻率和ε3/ε3為主的基因型[9]。因缺乏納入患者他汀用藥的具體信息，故本研究沒有繼續(xù)深入探討這71例患者SLCO1B1和ApoE多態(tài)性和他汀用藥的相關(guān)性。

A.criteria for interpreting results by RT-qPCR; B.SLCO1B1 SNPs analysis; C.ApoE SNPs analysis

圖2 MALDI-TOF-MS檢測SLCO1B1和ApoE多態(tài)性位點(diǎn)

目前市場上檢測SNP的商品化試劑盒多是基于RT-qPCR或基因芯片法，這些方法基于化學(xué)(熒光)方法，依賴于核苷酸的互補(bǔ)性對核酸序列進(jìn)行分析，對序列的長度、復(fù)雜性和反應(yīng)條件等具較高的要求，易受多種化學(xué)因素的影響，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。MALDI-TOF-MS依賴于分子量這一物理參數(shù)，是根據(jù)核苷酸組成分子被電離后在真空管中的飛行時(shí)間來確定其分子量大小，最終確定核苷酸序列。此外，RT-qPCR技術(shù)只適用于對有限的基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，MALDI-TOF-MS可在同一反應(yīng)體系中對多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行多重檢測和分析，可大幅提高檢測通量和效率，是對現(xiàn)有RT-qPCR的重要補(bǔ)充。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MALDI-TOF-MS與RT-qPCR兩種方法在檢測結(jié)果上具高度一致性，但有1例樣本出現(xiàn)差異，MS復(fù)檢時(shí)得到與RT-qPCR一致的結(jié)果，說明重復(fù)檢測可提高M(jìn)ALDI-TOF-MS的準(zhǔn)確性，建議在實(shí)際應(yīng)用中針對每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)重復(fù)檢測。

表1 研究對象SLCO1B1的基因型分布

表2 研究對象ApoE基因型及等位基因的分布

本研究首次建立了MALDI-TOF-MS對于SLCO1B1和ApoE常見多態(tài)性位點(diǎn)的檢測方法，并與RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明MALDI-TOF-MS與RT-QPCR的檢測結(jié)果有較好的一致性。綜上所述，MALDI-TOF-MS技術(shù)可應(yīng)用于脂質(zhì)和藥物代謝相關(guān)基因檢測，其臨床適用性仍需結(jié)合臨床具體用藥情況和個(gè)體化的反應(yīng)進(jìn)一步分析。