韓 玲，楊 科，薛 征，呂 湘

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組已廣泛用于精確的DNA編輯[1]，為遺傳性疾病的徹底治療帶來(lái)希望。其編輯效率相對(duì)經(jīng)典同源重組修復(fù)(homology-directed repair，HDR)顯著提高，達(dá)0.35%～10%，但總體效率仍偏低[2-4]。結(jié)合非特異突變的引入和單細(xì)胞克隆形成率低等因素，獲取成功編輯的單克隆細(xì)胞株仍然費(fèi)時(shí)費(fèi)力。單堿基編輯技術(shù)在嘧啶之間或嘌呤之間實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)換，但轉(zhuǎn)換形式受限且特異性較差[5-6]。最新的先導(dǎo)編輯(prime editing)實(shí)現(xiàn)了堿基間自由轉(zhuǎn)換，且脫靶和插入缺失率低[7]，而編輯區(qū)段偏小，目前也無(wú)法完全替代同源重組法構(gòu)建突變細(xì)胞。

本研究旨在改進(jìn)同源重組法構(gòu)建定點(diǎn)突變細(xì)胞株的后期篩選策略，提高對(duì)成功編輯細(xì)胞的單克隆篩選效率。以rs826415位點(diǎn)[8]為例，通過CRISPR/Cas9同源重組法在K562細(xì)胞中引入G/G 到T/G突變。打靶細(xì)胞多克隆培養(yǎng)后，通過陣列式標(biāo)簽高通量測(cè)序法分析確定陽(yáng)性率最高的多克隆細(xì)胞，再?gòu)闹泻Y選成功編輯的單克隆細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體和同源重組修復(fù)模板：pX330載體[Addgene(Ad42230)]，同源重組模板包含T-型rs826415位點(diǎn)及其兩側(cè)各50 nt的序列(5′-TCA GCTAGAGCTAGCACCGCTGCTATCTCCTGTGCCCAG GCTGTTTGTCATCTTTTTACCTCCTCTGCTTCTGAGG CTGACTTTAGCTGTGGGGAGACCTG-3′)。

細(xì)胞系：人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T、人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.2 試劑：超低內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(Magen公司)；限制性內(nèi)切酶、T7E1內(nèi)切酶和高保真PCR酶(NEB公司)；DNA膠回收試劑盒和DNA clean &concentrator-5試劑盒(ZYMO公司)，LB Broth Powder(Sangon公司)；氨芐西林鈉(山東魯抗醫(yī)藥公司)；VigoFect高效真核轉(zhuǎn)染試劑(Vigorous公司)；NeonTM轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；胎牛血清(Hyclone公司)； 2×Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶和N411 DNA純化磁珠(Vazyme公司)。

1.2 方法

1.2.1 pX330-sgRNA-1～6質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)CRISPR DESIGN(http://crispr.mit.edu/)在rs826415位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9 sgRNA，并通過Blast分析其序列特異性，共設(shè)計(jì)6條sgRNA(表1, 圖1A)，末端添加BbsI接頭序列，sgRNA雙鏈退火后連接到經(jīng)BbsⅠ線性化的pX330載體。

表1 靶向rs826415鄰近區(qū)域的sgRNA-1～6引物序列

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)：用DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T細(xì)胞。用RPMI 1640完全培 養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)K562細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：提前24 h將5×105個(gè)293T細(xì)胞鋪到12孔板中，轉(zhuǎn)染前2 h換為新鮮的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時(shí)分別混勻1 μL vigoFect和50 μL 0.9% 氯化鈉溶液，及1 μg pX330-sgRNA-1～6質(zhì)粒和50 μL 0.9%氯化鈉溶液，然后將兩種溶液混合，室溫靜置10 min，逐滴加入細(xì)胞中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

收集1×106個(gè)K562細(xì)胞，用PBS清洗，每孔以110 μL NeonTM轉(zhuǎn)染系統(tǒng)配套的R緩沖液重懸細(xì)胞，將5 μg pX330-sgRNA-6質(zhì)粒、1 μL同源重組模板(100 μmol/L)和110 μL細(xì)胞重懸液混合，取100 μL混合液置于Neon Tube，按以下參數(shù)：1 450 V，3(ms)，10 pulse進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞放入提前準(zhǔn)備好的含10% FBS的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 T7E1酶切實(shí)驗(yàn)：通過PCR擴(kuò)增含有sgRNA靶向位點(diǎn)的DNA片段(表2)，電泳并純化回收PCR產(chǎn)物，取250 ng回收產(chǎn)物加入2 μL 10×NEB 限制性內(nèi)切酶緩沖液2，加ddH2O至20 μL后變性和退火，向退火產(chǎn)物中加入1 μL T7E1內(nèi)切酶混勻37 ℃酶切30 min，加1 μL蛋白酶K，37 ℃孵育5 min失活T7E1，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)切割效率。

表2 T7E1酶切實(shí)驗(yàn)引物序列

1.2.5 陣列式標(biāo)簽法PCR擴(kuò)增：1)有限稀釋法獲取多克隆細(xì)胞：電轉(zhuǎn)細(xì)胞48 h后，使用有限稀釋法于96孔板中按每孔10～20個(gè)細(xì)胞接種，獲取多克隆細(xì)胞。2)裂解細(xì)胞：待細(xì)胞擴(kuò)增至約104個(gè)/孔的密度后，取各孔半數(shù)細(xì)胞加50 μL消化液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，500 mmol/L KCl，0.1 mg/mL gelatin，0.45% NP40)及1 μL蛋白酶K，65 ℃水浴4 h裂解細(xì)胞，100 ℃，10 min終止反應(yīng)。3)陣列式標(biāo)簽PCR(1st round PCR)：以1 μL消化產(chǎn)物為模板，通過PCR擴(kuò)增各孔細(xì)胞的基因組DNA。針對(duì)rs826415兩側(cè)序列(-220 bp～79 bp，總長(zhǎng)300 bp)設(shè)計(jì)引物，在引物中加入barcode標(biāo)簽序列以區(qū)分來(lái)自各孔細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)物，并加入不同長(zhǎng)短的stagger序列以平衡混合PCR產(chǎn)物二代測(cè)序時(shí)序列讀出的準(zhǔn)確性。由于二代測(cè)序的接頭序列加上特異引物長(zhǎng)度較長(zhǎng)(總長(zhǎng)達(dá)85～97 bp)，采用兩步PCR進(jìn)行擴(kuò)增，本步驟為第1輪擴(kuò)增。上游引物組成：5′-P5 adapter(truncated)+stagger+barcode_P5+primer-F-3′，其中的barcode_P5共12種，分別標(biāo)記96孔板的12縱列引物分別命名為P5_1～12；下游引物組成：5′-P7 adapter(truncated)+stagger+barcode_P7+primer-R-3′，其barcode_P7共8種，分別標(biāo)記96孔板的8橫排，引物分別命名為P7_A～H(表3)。4)PCR產(chǎn)物純化和2次PCR擴(kuò)增(2nd round PCR)：混合上述來(lái)自不同多克隆細(xì)胞的PCR產(chǎn)物(共96個(gè))，加2.5倍體積的無(wú)水乙醇，0.1倍體積的3 mol/L 醋酸鈉(pH 5.2)，-20 ℃冰箱靜置30 min，4 ℃，12 000×g，離心10 min，棄上清，加75%乙醇洗滌2遍后，以預(yù)熱的ddH2O溶解沉淀，并通過DNA回收試劑盒柱純化回收。通過高保真的2×Phanta Max Master Mix對(duì)純化的DNA進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，引入完整的P7/P5二代測(cè)序建庫(kù)引物和用以區(qū)分本實(shí)驗(yàn)與他人測(cè)序樣品的index序列(表4)。擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠純化去除引物等小片段后送二代測(cè)序。

1.2.6 二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析：Illumina雙端測(cè)序得到fastq.gz文件，Trimmomatic軟件分析去除低質(zhì)量reads得到fastq.gz格式的cleandata。用migec軟件[9]根據(jù)雙端測(cè)序文件中的barcode，把fastq.gz文件拆成96對(duì)不同fastq.gz文件，具體來(lái)說(shuō)，先通過P5端所含的12種barcode拆分成12種fastq.gz文件，再通過P7端所含的8種barcode將上步所得12種fastq.gz文件進(jìn)一步拆解成96種，分別對(duì)應(yīng)各培養(yǎng)孔內(nèi)的多克隆細(xì)胞。最后通過CRISPR-DAV[10]中的crispr.pl軟件批量分析96對(duì)雙端測(cè)序文件中發(fā)生同源重組和非同源末端連接產(chǎn)物的比例，將編輯后的細(xì)胞基因組分為未發(fā)生同源重組(wild type)、同源重組但伴隨插入缺失(HDR with indel)和同源重組且無(wú)插入缺失(HDR without indel)3種情況，其中‘HDR without indel’類型為成功突變的陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)重組率、錯(cuò)配率指標(biāo)篩選‘HDR without indel’比率最高的多克隆。

表3 陣列式標(biāo)簽PCR引物序列設(shè)計(jì)

Orange: P5 adapter(truncated); green: P7 adapter(truncated); underline: overlap with the 2ndround PCR primers; yellow: stagger; red: barcode_P5/P7; blank: primer-F/R specific for the rs826415 surrounding region.

表4 二次PCR擴(kuò)增引物序列

Orange: P5 adapter; green: P7 adapter; dark green: index; underline: overlap with the 1stround PCR primers.

1.2.7 進(jìn)一步單克隆培養(yǎng)及基因型的鑒定：通過流式分選將選定的多克隆中細(xì)胞單個(gè)分配到96孔板的每個(gè)孔，待細(xì)胞擴(kuò)增至約104個(gè)，取部分細(xì)胞裂解，通過未加barcode的primer-F/R擴(kuò)增含有rs826415位點(diǎn)的目的片段(primer-F：5′-TAGGAT CTCCACAGCTAGCCA-3′，primer-R：5′-GAGGTAAA GGCTCTGCCAGG-3′)，而后通過Sanger測(cè)序鑒定基因型。

2 結(jié)果

2.1 電轉(zhuǎn)后細(xì)胞單克隆形成率低

將電轉(zhuǎn)后的K562細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，14 d后統(tǒng)計(jì)單細(xì)胞存活率，8個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中共138個(gè)孔有活細(xì)胞，概率約為17.9%。另外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組效率常出現(xiàn)低于1%的情況[3](本文是0.62%)，并可高比例伴隨插入/缺失等其他形式突變，按傳統(tǒng)方法獲得攜帶目的突變的單克隆細(xì)胞株通常需要篩選10～20塊以上的96孔板。

2.2 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562細(xì)胞rs826415位點(diǎn)引入G到T點(diǎn)突變

單核苷酸多態(tài)性rs826415(T/G)位點(diǎn)常見等位基因T，少見等位基因?yàn)镚，在K562細(xì)胞中rs826415位點(diǎn)為G/G純合型。在rs826415附近設(shè)計(jì)6條sgRNA(sgRNA-1～6)(表1，圖1A)克隆到pX330質(zhì)粒載體，同時(shí)根據(jù)rs826415前后各50 bp的序列設(shè)計(jì)總長(zhǎng)101 bp，rs826415位點(diǎn)為T的ssDNA作為同源重組模板(圖1B)。在293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pX330-sgRNA-1～6質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)后用T7E1酶檢測(cè)Cas9的切割效率，結(jié)果顯示sgRNA-3、sgRNA-5、sgRNA-6切割效率較高(表2，圖1C)，選擇pX330-sgRNA-6質(zhì)粒與同源重組模板共同電轉(zhuǎn)K562細(xì)胞。

2.3 陣列式標(biāo)簽PCR擴(kuò)增法構(gòu)建打靶細(xì)胞二代測(cè)序文庫(kù)

轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞于96孔板中多克隆培養(yǎng)，克隆形成率為100%。通過兩步PCR法擴(kuò)增各多克隆細(xì)胞中含有rs826415的區(qū)域，并在雙端引物中分別加入barcode_P5_1～12和barcode_P7_A～H對(duì)各多克隆擴(kuò)增產(chǎn)物予以特異標(biāo)記，引物設(shè)計(jì)和標(biāo)記排布方式如圖表所示(表3,4;圖2A,B)。擴(kuò)增產(chǎn)物的混合文庫(kù)用于進(jìn)一步的二代測(cè)序分析?？紤]添加了barcode等附加序列可能會(huì)影響引物結(jié)合的序列特異性，在正式擴(kuò)增鑒定細(xì)胞克隆之前先確定引物擴(kuò)增的特異性，結(jié)果顯示分別添加不同長(zhǎng)短附加序列的3對(duì)引物均可獲得特異性良好的擴(kuò)增條帶(圖2C)。

2.4 二代測(cè)序分析篩選陽(yáng)性率最高的多克隆

陣列式標(biāo)簽PCR擴(kuò)增的混合文庫(kù)首先通過Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量控制檢查，檢測(cè)結(jié)果顯示文庫(kù)主帶在431 bp左右，產(chǎn)物大小合適，沒有小片段污染，說(shuō)明文庫(kù)建庫(kù)質(zhì)量合格(圖3A)，雙端測(cè)序(2×150 bp)后分析每孔多克隆細(xì)胞的同源重組率和插入缺失率。96個(gè)多克隆的HDR發(fā)生率在0%～9.79%之間，平均(總HDR/ 總reads數(shù))為0.62%，其中效率最高的4個(gè)多克隆為克隆‘B7’、‘D2’、‘D8’和‘H2’(圖3B)。進(jìn)一步indel分析提示克隆‘B7’、‘D2’、‘H2’中的重組以‘HDR with indel’為主， ‘D8’的‘HDR without indel’比率最高，達(dá)4.35%(圖3C)。96個(gè)多克隆的平均‘HDR without indel’僅為0.21%?？寺　瓺8’中陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于平均水平，可用于進(jìn)一步的單克隆培養(yǎng)鑒定。

A.candidate sgRNAs at the rs826415 surrounding region；B.single strand oligo (SSO) used as homologous template for G to T mutation；C.T7E1 assay of candidate sgRNA activity; the size of uncut PCR product was 498 bp, T7E1 cut resulting bands of different size depending on specific position of each sgRNA; positive control was a rs826415-irrelevant sample provided with T7E1 enzyme

圖1 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562 rs826415位點(diǎn)引入G 到T點(diǎn)突變

Fig 1 Introducing G to T point mutation at rs826415 site of K562 cells using CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination

A.primer designing for the array tagged PCR amplification；B.array arrangement of barcode sequences tagged to the primers (P5_1～12, P7_A～H) for the rs826415-targeted K562 polyclone screening on a 96-well plate；C.examination of sequence specificity of the tagged primers; #1: specific primers for rs826415 surrounding region (untagged, as shown in black in Table 2); #2: the P5_1 and P7_A primers used for the 1st round PCR amplification; #3: primers for the 2nd round PCR amplification；PCR product products were 300 bp, 378 bp and 434 bp in length for primers #1, #2 and #3 respectively

圖2 陣列式標(biāo)簽PCR擴(kuò)增法構(gòu)建rs826415位點(diǎn)打靶的多克隆K562細(xì)胞二代測(cè)序文庫(kù)

Fig 2 Array tagged PCR amplification to generate NGS library from the rs826415-targeted K562 polyclones

2.5 單克隆突變細(xì)胞的篩選鑒定

從克隆‘D8’中分選出96個(gè)單細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，共獲得30個(gè)單克隆，克隆形成率為31.25%(30/96)。從每個(gè)單克隆中取部分細(xì)胞用作基因型測(cè)序鑒定，經(jīng)序列比對(duì)及原始數(shù)據(jù)分析，成功篩選到一個(gè)rs826415位點(diǎn)突變?yōu)門/G雜合基因型且沒有其他插入缺失突變的單克隆細(xì)胞株(圖4A,B)，陽(yáng)性率為3.33%(1/30)，與克隆‘D8’中4.35%的陽(yáng)性率相符，未檢測(cè)到純合型突變細(xì)胞。

3 討論

CRIPSR/Cas9系統(tǒng)為基因編輯提供了有效的工具，但其介導(dǎo)同源重組獲得精確編輯的點(diǎn)突變細(xì)胞效率仍然偏低，相對(duì)早期胚胎和干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，體細(xì)胞中的編輯效率更低，常在1%以下[3]，因而需要篩選大量細(xì)胞以獲得陽(yáng)性克隆。篩選過程中由于轉(zhuǎn)染和流式分選等引起細(xì)胞損傷、單細(xì)胞不易增殖及流式分選不能確保每個(gè)培養(yǎng)孔都分到單細(xì)胞等因素，常導(dǎo)致基因打靶后細(xì)胞在單克隆培養(yǎng)過程中克隆形成率低，篩選鑒定工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。使用正負(fù)篩選標(biāo)記可大大提高陽(yáng)性克隆率，減少基因鑒定的工作量，但細(xì)胞培養(yǎng)消耗不減且需要更為復(fù)雜的打靶設(shè)計(jì)。

A.Agilent 2100 Bioanalyzer analysis of the NGS library constructed from the rs826415-targeted K562 polyclones; B.percentages of wide type (WT), edited (include HDR) and HDR reads in the four rs826415-targeted K562 polyclones of the highest HDR ratio; C.indel analysis of the HDR reads in the four polyclones as shown in panel B

圖3 二代測(cè)序分析篩選陽(yáng)性率最高的rs826415位點(diǎn)打靶K562細(xì)胞多克隆

Fig 3 NGS analysis to identify the rs826415-targeted K562 polyclone with the highest ratio of ‘HDR without indel’

已有研究通過標(biāo)簽標(biāo)記的二代測(cè)序法篩選96孔板中CRISPR/Cas9編輯的單克隆細(xì)胞，提高篩選效率，但只針對(duì)單克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選，未解決單細(xì)胞存活率低及HDR效率低等問題[11]。本研究通過多克隆法先分得每孔10～20個(gè)細(xì)胞以提高細(xì)胞存活率，通過陣列式標(biāo)簽標(biāo)記的二代測(cè)序分析篩選‘HDR without Indel’比率最高的多克隆，與平均HDR相比篩選出的多克隆細(xì)胞HDR效率顯著增加，僅篩選兩個(gè)96孔板即獲得陽(yáng)性突變克隆。其中多克隆培養(yǎng)時(shí)每孔的初始細(xì)胞數(shù)目可根據(jù)情況調(diào)整。本研究取10～20個(gè)細(xì)胞/孔，預(yù)期陽(yáng)性孔中HDR效率可提高到5%～10%。若平均HDR效率較高時(shí)可將每孔接種的細(xì)胞數(shù)減少，再分選單細(xì)胞克隆時(shí)陽(yáng)性率會(huì)更高。

目前本研究只獲得了雜合型的定點(diǎn)突變克隆，為提高精確基因編輯的純合型細(xì)胞得率可采取添加非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)抑制劑，使用Cas9的不同變體[2]、CRISPR核糖核蛋白[CRISPR ribonucleoprotein(RNP)]等方法提高HDR效率。另有研究發(fā)現(xiàn)β-腎上腺素受體激動(dòng)劑小分子L755507顯著促進(jìn)HDR效率、 在CRISPR/Cas9及單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的基因精確編輯中促進(jìn)作用高達(dá)9倍[12]。

A.sanger sequencing of rs826415 surrounding region (complementary strand is shown), WT: wildtype K562 cells; heterozygote: K562 cells showed G/T heterozygous at rs826415 site without indel, heterozygote with indel: K562 cells showed G/T heterozygous at rs826415 site with undesired indel mutation detected; B.analyzed and RAW electropherograms of rs826415 surrounding region in the heterozygote K562 cells;*background signal

圖4 Sanger測(cè)序鑒定rs826415位點(diǎn)成功G到T點(diǎn)突變的K562單克隆細(xì)胞株

Fig 4 Sanger sequencing identification of monoclonal K562 cells harboring the desired G to T mutation at rs826415 site

本研究?jī)?yōu)化出一套通過標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測(cè)序策略預(yù)篩選多克隆細(xì)胞，進(jìn)而高效鑒定點(diǎn)突變單克隆細(xì)胞株的方法。除點(diǎn)突變之外，該方法也適用于對(duì)更長(zhǎng)序列進(jìn)行編輯時(shí)提高打靶細(xì)胞的篩選效率，在當(dāng)前精確基因編輯效率仍偏低的情況下，為后續(xù)在細(xì)胞及臨床水平進(jìn)行基因精確編輯的研究和應(yīng)用提供便利。