ADD3 基因rs17095355 位點多態(tài)性與膽道閉鎖相關性研究的Meta 分析

衛(wèi)園園 范晉楠 李亞蕊

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是新生兒及嬰兒期阻塞性黃疸的主要病因之一，其以肝內、肝外膽道閉塞為主要特征，可導致不可控制、迅速發(fā)展的進行性肝纖維化，如不及時治療，患兒常在1 歲內死亡［1，2］。 BA 的病因目前仍不清楚，可能與多種因素（如發(fā)育異常、遺傳易感性、血運障礙、病毒感染、膽汁酸代謝異常、免疫及炎癥反應等）有關［3，4］。 BA的發(fā)病率有明顯的種族和地區(qū)差異，其中亞洲地區(qū)明顯高于歐美地區(qū)［5，6］。 此外，有研究報道家庭中數(shù)名BA 患兒，以及母親與孩子同患BA 的文獻［7］。這提示BA 的發(fā)病存在遺傳因素的作用。 Garcia-Barcelo 等［8］于2010 年對中國人群中BA 患兒進行了首個全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），發(fā)現(xiàn)了10 個與BA 相關性較大的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，其中相關性最強的是rs17095355 位點，分析顯示該位點的OR值及其95%CI為1.77 （1.38 ～2.26），增加了BA 的易患性。 rs17095355 位點位于ADD3基因上，胞嘧啶可轉換為胸腺嘧啶（C ＞T），隨后在泰國以及其他中國人群中的研究也發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性顯著增加了BA 的易患風險，而Tsai 等的研究結論與上述不同［9-14］。 本研究擬對rs17095355 位點多態(tài)性與膽道閉鎖相關性研究進行Meta 分析，為膽道閉鎖的發(fā)病機制提供線索。

材料與方法

一、檢索策略

檢索的數(shù)據(jù)庫包括英文數(shù)據(jù)庫（PubMed、EMbase、Web of Science）及中文數(shù)據(jù)庫（中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺、維普期刊資源整合服務平臺和中國生物醫(yī)學文獻服務系統(tǒng)）。 檢索時間截至2019 年7 月。 英文檢索詞：“biliary atresia”O(jiān)R“bile duct atresia ”、 “ rs17095355 ” OR “ ADD3 ” OR“XPNPEP1”、“polymorphism”O(jiān)R“genetic variant”O(jiān)R“genetic variation”等。 中文檢索詞：“膽道閉鎖”、“rs17095355 或ADD3 或XPNPEP1”、“多態(tài)性”等。

二、文獻納入及排除標準

納入標準： ①人群研究或病例對照研究； ②研究內容包括rs17095355 位點與膽道閉鎖相關性； ③語種為中文或英文； ④能夠提供各個等位基因在病例組和對照組中的頻數(shù)分布用于計算比值比（odds ratio，OR）。 排除標準： ①不能提供完整數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)存在明顯錯誤的文獻； ②通信、綜述、病例報道、會議摘要、期刊述評、專家意見； ③未設立對照組。 閱讀標題和摘要，依據(jù)納入及排除標準進行初步篩選，排除不符合要求的文獻，通讀入選文獻后進行再次篩選。

三、信息提取和文獻質量評價

對納入文獻使用自擬提取表提取資料，提取信息包括文獻特征（第一作者姓名、發(fā)表年份、研究人群等）以及病例組與對照組的例數(shù)、等位基因頻率等。 采用紐卡斯爾-渥太華（Newcastle-Ottawa scale，NOS）量表對納入文獻進行質量評價，內容包括： ①研究人群選擇：診斷是否明確（1 分），病例是否具有代表性（1 分），對照來源（1 分），對照確定（1 分）；②組間可比性：設計和統(tǒng)計分析時考慮病例組和對照組的可比性（2 分）； ③暴露因素測量：暴露因素確定（1 分），暴露是否采用相同檢測方法（1 分），無應答率（1 分）。 總分9 分，5 分以上可視為高質量文獻。 整個過程由兩位評價者獨立完成，不一致處經(jīng)討論后決定。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用Stata 14.0 軟件。 應用Q 檢驗法（χ2檢驗）對所納入的研究進行異質性檢驗，同時計算I2統(tǒng)計量，以P≤0.1 為存在異質性。 當同時滿足P＞0.1 和I2≤40%時，采用固定效應模型，反之則采用隨機效應模型［15］。OR值計算方法為實驗組中某等位基因或基因型與其它等位基因或基因型之比除以對照組之比，OR＝1 提示該因素對疾病的發(fā)生不起作用，95%CI下限＞1 提示可能為危險因素，上限＜1時提示可能為保護因素，上述結果均采用Stata 14.0計算。 假定T 等位基因為危險基因，分別計算在等位基因遺傳模型（Tvs.C）、顯性基因遺傳模型（TT+CTvs.CC）、隱性基因遺傳模型（TTvs.CT +CC）下的合并OR值及其95%CI。 并按樣本量大小進行亞組分析。 使用在線工具驗證對照組基因頻率分布是否符合H-W 遺傳平衡定律。 并逐一剔除每一項研究進行敏感性分析。 采用漏斗圖觀察發(fā)表偏倚，并用Egger's檢驗評價漏斗圖的對稱性，P＞0.1 時可判斷漏斗圖對稱，無明顯發(fā)表偏倚。

結 果

一、文獻檢索結果

共檢索到2019 年7 月以前發(fā)表的相關文獻33篇，剔除重復文獻后獲得12 篇，其中綜述3 篇，其它基因1 篇，研究對象非人群1 篇。 排除上述不符合納入標準的文獻，最終納入7 篇文獻，見圖1。

圖1 文獻檢索納入排除流程圖Fig.1 Flow diagram of study selecting

二、納入文獻概況及質量評價

7 篇文獻發(fā)表時間為2010—2018 年，共包括8組獨立樣本研究（Garcia-Barcelo 等2010 年的研究中包括兩組獨立樣本），均為病例對照研究。 7 組研究對象為亞洲人群［8-13］，1 組研究對象為高加索人［14］。 納入文獻中有2 篇樣本量≥1 000 例［12，14］；3篇文獻明確提及采用通用診斷標準［12-14］，2 篇文獻中為已行Kasai 手術患兒［10，11］；所有文獻對照組基因分布均符合H-W 遺傳平衡定律；SNP 檢測方法包括Sanger 直接測序法、Taqman 探針法、基因芯片法；4 篇文獻對照組來源于健康人群［9-11，14］。 所納入文獻NOS 評分均＞5 分。 入選文獻基本特征、質量評價及rs17095355 位點等位基因分布情況見表1。

表1 入選文獻基本特征和NOS 評分及rs17095355 位點等位基因分布情況Table 1 Major characteristics and quality evaluations of eligible studies and the distribution of rs17095355

三、rs17095355 位點SNP 與膽道閉鎖關聯(lián)性分析

Meta 分析結果顯示，等位基因遺傳模型下rs17095355 位點多態(tài)性與膽道閉鎖患病風險的合并OR值及95%CI為1.66（1.44 ～1.90），見圖2。 亞洲人群中等位基因遺傳模型下該位點多態(tài)性與膽道閉鎖患病風險的合并OR值及95%CI為1.72（1.48 ～1.99），見圖3。 對所有研究按樣本量大小是否≥1 000 人進行亞組分析后，異質性減少。 在樣本量＜1 000 人組和樣本量≥1 000 人組中，該位點均增加了BA 的易患性，合并OR值及95%CI分別為1.84 （1.63 ～2.07）和1.32（1.16 ～1.50），見圖4。 其中4 組研究提供了BA 組與對照組具體的基因型分布例數(shù)［10-13］，見表2。 在顯性基因遺傳模型（TT+CTvs.CC）、隱性基因遺傳模型（TTvs.CT +CC）下rs17095355 位點多態(tài)性均使膽道閉鎖的患病風險增加，OR值及95%CI分別為1.66（1.38 ～2.01）和2.16（1.38 ～3.37），見表3。

四、敏感性分析

逐個去掉任何一項研究，對等位基因模型下rs17095355 位點基因多態(tài)性與膽道閉鎖關聯(lián)性研究的Meta分析結果進行敏感性分析，發(fā)現(xiàn)對合并OR值的影響不大（圖5）。

圖2 等位基因遺傳模型下rs17095355 位點多態(tài)性與BA 關聯(lián)的森林圖Fig.2 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model

圖3 亞洲人群中等位基因遺傳模型下rs17095355 位點多態(tài)性與BA 關聯(lián)的森林圖Fig.3 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model in Asian populations

圖4 按樣本量大小進行亞組分析后等位基因遺傳模型下rs17095355 位點多態(tài)性與BA 關聯(lián)的森林圖Fig.4 Forest plots of rs17095355 polymorphism and BA in allele genetic model by subgroup analysis

表2 BA 組與對照組基因型分布情況（n）Table 2 The distribution of genotypes in four studies（n）

表3 不同遺傳模型下rs17095355 位點與膽道閉鎖的關聯(lián)Table 3 Meta-analysis of rs17095355 polymorphism and biliary atresia risk

圖5 敏感性分析Fig.5 Sensitivity analysis

五、發(fā)表偏倚

對等位基因模型下rs17095355 位點多態(tài)性與膽道閉鎖關聯(lián)性研究的Meta 分析采用Egger's 檢驗進行發(fā)表偏倚的統(tǒng)計學檢驗，發(fā)現(xiàn)存在發(fā)表偏倚（t＝2.72，P＝0.035）。

討 論

膽道閉鎖的病因及發(fā)病機制至今尚未完全明確，包括遺傳因素、血運障礙、病毒感染、膽汁酸代謝異常、免疫及炎癥反應等多種因素［3，4］。 單核苷酸多態(tài)性是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占基因多態(tài)性的80%以上。 基于對BA 發(fā)病機制的探索和對遺傳學認識的深入，以及基因分型技術的發(fā)展，越來越多的學者關注著基因、SNP 與BA 之間的關系，進行了諸多尋找和驗證BA 易感基因的研究［8-14］。 本次Meta 分析納入了7 篇關于rs17095355位點多態(tài)性與BA 相關性的文獻，共包括8 組獨立樣本研究。 其中1 組研究對象為高加索人，剩余7組均為亞洲人，包括5 組中國人群研究和2 組泰國人群研究［8-14］。 本Meta 分析結果顯示，在3 種遺傳模型包括等位基因遺傳模型、顯性基因遺傳模型和隱性基因遺傳模型下，rs17095355 位點多態(tài)性均增加了膽道閉鎖的患病風險，OR值及95%CI分別為1.66（1.44 ～1.90）、1.66（1.38 ～2.01）和2.16（1.38 ～3.37）。

8 組研究均采用病例對照研究探討了等位基因遺傳模型下rs17095355 位點與BA 的相關性。 Garcia-Barcelo 等［8］于2010 年進行了首個基于中國BA患兒的GWAS 研究，篩選出了10 個與BA 相關性最強的SNPs，其中就包括10q24.2 區(qū)的rs17095355 位點，分析顯示該位點OR值及95%CI為1.77 （1.38～2.26） ，差異有統(tǒng)計學意義（P＝4.75 ×10-6）。隨后獨立樣本（124 名BA 患兒和90 名健康兒童）的驗證結果中同樣發(fā)現(xiàn)rs17095355 位點與BA 相關性最強，OR值及95%CI為2.13（1.42 ～3.20） ，差異有統(tǒng)計學意義（P＝6.94 ×10-9）。 此后關于亞洲人群中該位點與BA 易感性的文獻包括2011 年Kaewkiattiyot 等［10］及2018 年Laochareonsuk 等［11］在泰國人群，以及2013 年Cheng 等［9］、2014 年Zeng等［13］和2018 年Wang 等［12］在中國人群中的研究。其中Wang 等［12］研究總人數(shù)超過1 000 人，計算的OR值及95%CI為1.33（1.15 ～1.54） ，差異有統(tǒng)計學意義（P＝1.60 ×10-4），相較其他研究稍低。 本Meta 分析計算顯示亞洲人群中該位點在等位基因遺傳模型下的合并OR值及95%CI為1.72（1.48 ～1.99），與大部分研究結果相近。 考慮到納入研究中僅1 組針對高加索人，其余均為亞洲人群的研究，故未對種族進行亞組分析。 唯一以高加索人為研究對象的數(shù)據(jù)來自Tsai 等，該研究總樣本量超過1 000人，包括171 名BA 患兒與1 630 名對照，結果發(fā)現(xiàn)rs7099604 為10q24.2 區(qū)與BA 相關性最強的SNP 位點，OR值及95%CI為1.45（1.09 ～1.92），差異有統(tǒng)計學意義（P＝2.46 ×10-3），而非rs17095355 位點，OR值及95%CI為1.29（0.98 ～1.71），差異有統(tǒng)計學意義（P＝2. 65 × 10-2），不同于亞洲人群［14］。 已知BA 發(fā)病率存在種族差異［5，6］，亞洲國家可達歐美國家的兩倍［16］。 亞洲人群與高加索人群中rs17095355 位點OR值的差異可能與此因素有關［14］。 7 篇文章中4 篇提供了BA 組與對照組的基因型分布情況，結果發(fā)現(xiàn)在顯性基因遺傳模型、隱性基因遺傳模型下rs17095355 位點多態(tài)性均使膽道閉鎖的患病風險增加，但納入研究數(shù)量較少，結果的可信度受到限制［10-13］。 考慮到該類研究中由于某些基因較低或較高的最小等位基因頻率（minimal allele frequency，MAF）值及樣本量的不足等因素很容易出現(xiàn)統(tǒng)計結果的假陽性、假陰性，因此本研究以樣本量大小是否超過1 000 人對研究規(guī)模進行了亞組分析，結果發(fā)現(xiàn)兩組中該位點均增加了BA的易感性，而異質性減少，提示樣本量可能是異質性的來源。 因此，更可靠的結果有待不同種族中更多樣本量大、數(shù)據(jù)詳細的研究來驗證。

值得注意的是，目前對SNP 的研究不僅集中在疾病易感性，隨著認識的深入，越來越多的研究也開始關注SNP 對基因功能的影響與疾病的關系［17，18］。 rs17095355 位點位于10q24 區(qū)的ADD3基因上，同樣位于該區(qū)XPNPEP1基因的上游。ADD3基因編碼一種膜骨架蛋白即內收蛋白3，可促進肝臟、膽道上皮細胞細胞間連接、黏附，調節(jié)細胞的遷移及黏附，而膽小管細胞的收縮需要肌動蛋白-肌球蛋白相互作用，若該機制障礙可出現(xiàn)膽汁淤積［19］。XPNPEP1表達于肝膽上皮細胞中，編碼氨肽酶P1，該酶特異性地催化N 端與倒數(shù)第二位脯氨酸相連氨基酸的裂解，參與膽汁酸的代謝、分泌及炎癥過程［10］。 免疫組化研究顯示，XPNPEP1在膽道上皮細胞及肝細胞中都有表達，而ADD3 特異性地表達于膽道上皮細胞中，在肝細胞中很少或不表達［14］。 此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，XPNPEP1基因敲除的斑馬魚很少或不發(fā)生膽道異常，但在ADD3敲除后可存在肝內膽道結構的缺陷［14］。 關于rs17095355位點多態(tài)性是否影響ADD3或XPNPEP1基因的功能，數(shù)名研究者進行了探討［8-10，14］。 Garcia-Barcelo等［8］通過生物信息學分析（Genomatix suite）發(fā)現(xiàn)，rs17095355 位點的C ＞T 改變了轉錄因子結合位點（transcription factor binding sites，TFBSs），然而這一轉換對包含該位點及其周圍的序列并無功能學影響。 Tsai 等［14］采用qPCR 法檢測正常對照、肝內膽汁淤積和BA 肝臟中XPNPEP1和ADD3的表達，三組患者XPNPEP1表達無差異，而BA 與正常對照組之間的ADD3表達水平有差異（P＜0.001）。 Cheng等［9］通過生物信息學和體內基因表達研究發(fā)現(xiàn)，與BA 發(fā)病相關的調控性SNPs 與ADD3基因在肝臟中的蛋白表達有關系，而XPNPEP1則沒有。 這些均提示該位點可能通過影響ADD3的功能表達在BA發(fā)病中發(fā)揮作用。 大多數(shù)研究并未涉及rs17095355位點與BA 患兒臨床及病理特征是否存在關系。 僅Kaewkiattiyot 等［10］將BA 患兒分為無黃疸組（TB ＜2 mg/dL）和持續(xù)黃疸組（TB≥2 mg/dL） ，結果發(fā)現(xiàn)兩組間基因型及rs17095355 位點表達并無統(tǒng)計學差別。 rs17095355 多態(tài)性是否以及如何影響ADD3表達，是否與BA 患兒臨床特征及病理特點存在關系，還需要進一步探索。

本研究存在一定局限性。 ①膽道閉鎖的發(fā)病機制復雜，可能存在基因-基因、基因-環(huán)境的交互作用。 研究者們還對rs2501577、rs10509906 等SNP位點與膽道閉鎖患病風險的相關性進行了分析，并發(fā)現(xiàn)了一些具有意義的單體型，鑒于其它位點的意義及相關研究數(shù)量有限，本研究只針對rs17095355位點進行了分析。 此外，有學者認為膽道閉鎖是在遺傳學背景的基礎上，在環(huán)境因素作用下誘發(fā)的異常免疫反應［20，21］。 有報道異卵或同卵雙胞胎中只有1 人患BA 的情況，但目前關于膽道閉鎖的基因多態(tài)性研究中普遍缺乏病毒感染等環(huán)境因素資料。②本研究檢索了幾個主要的中英文數(shù)據(jù)庫，未包括其他語言撰寫的文獻，使納入研究的全面性受到了一定影響。 日本膽道閉鎖發(fā)病率相對較高，但所檢索文獻除中國、泰國外，無亞洲其他國家的相關研究數(shù)據(jù)，不能揭示亞洲其他國家rs17095355 位點基因多態(tài)性與膽道閉鎖的關系。 本研究的相關結果尚需在亞洲其他國家，以及美洲、歐洲等開展嚴格設計的病例對照或前瞻性研究加以驗證。 ③一般認為BA 可分為兩大類型：胚胎型（先天型）和圍生期型（獲得型），兩者發(fā)病機制有所不同。 納入文獻中約50%作者未注明膽道閉鎖類型［10-12，14］。 膽道閉鎖女孩多于男孩，但納入文獻無充足數(shù)據(jù)對性別進行亞組分析。 4 篇文獻提供了數(shù)據(jù)用于在顯性模型及隱性模型下進行比較，但樣本數(shù)量較少。 ④Cochrane 手冊中認為在納入研究數(shù)量少于10 個時，Egger 檢驗的效能和敏感性都受到限制，本研究在全面檢索后納入8 組研究，此時檢驗效能受到限制，因此盡管Egger 檢驗提示發(fā)表偏倚，本研究結果仍有參考價值。

總之，Meta 分析發(fā)現(xiàn)rs17095355 位點多態(tài)性與膽道閉鎖患病風險相關，T 等位基因可能是發(fā)生膽道閉鎖的危險因素，特別是在亞洲人群中。 然而以上結果仍需要來自亞洲其他地區(qū)以及美洲、歐洲等不同種族的更大規(guī)模的研究來將現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫建立得更加的龐大、豐富。 此外，rs17095355 位點是否以及如何影響相關基因的表達及功能，是否與BA患兒臨床及病理特征存在關聯(lián)，還需要進一步研究。