程傳民,李 云，柏 凡,王宇萍,陳 紅,李 茂，張 林

(四川省飼料工作總站，四川 成都 610041)

天然氨基酸分析是飼料分析的重要項(xiàng)目。目前氨基酸分析通常采用以下2種方式：離子交換色譜分離-柱后衍生(氨基酸分析儀)和柱前衍生-反相色譜法分離(高效液相色譜儀)[1-3]。在我國高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜普及率越來越高的情況下，本研究為飼料中氨基酸的檢測(cè)提供一種新的分析手段，采用微波消解法進(jìn)行前處理，解決了亮氨酸和異亮氨酸分離度達(dá)不到要求等問題，能夠滿足飼料中涉及的16種氨基酸分析需求[4-6]。

氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動(dòng)物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。自然界存在300多種氨基酸，但構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸只有20種，這20種氨基酸又稱為天然氨基酸。盡管天然氨基酸多達(dá)20種，但由于蛋白質(zhì)水解過程中天冬酰胺和谷氨酰胺分別轉(zhuǎn)化為天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸則以胱氨酸形式存在，色氨酸在酸水解時(shí)完全被破壞，因而對(duì)于含蛋白質(zhì)食品、飼料等樣品的氨基酸分析時(shí)，只需分析天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)等16種氨基酸[7-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1290/6460液質(zhì)聯(lián)用儀配有電噴霧源，美國Aglient；0.01 mg電子天平，德國賽多利斯公司;微波消解儀，美國Ethos Touch Control公司；渦旋振蕩器，禾本森科有限公司；電動(dòng)振蕩器，美國LKA-werke公司；高速冷凍離心機(jī)，Biofug Primo R公司。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，2.5 mol/L，SIGMA公司；乙腈、甲酸，色譜純，美國Fisher Scientific公司；甲酸銨，F(xiàn)isher chemical；鹽酸，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑公司。

甲酸銨溶液200 mmol/L pH 3.0：稱取6.3 g甲酸銨用水定容到500 ml，用甲酸調(diào)節(jié)pH值到3.0;氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液100 mmol/L：移取1 ml的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.5 mol/L于25 ml容量瓶中，用0.06 mol/L鹽酸溶液定容;流動(dòng)相A:10%甲酸銨溶液200 mmol/L pH 3.0水溶液;流動(dòng)相B:10%甲酸銨溶液200 mmol/L pH 3.0乙腈溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取試樣(20～30)mg于微波水解杯中,加6 mol/L鹽酸0.5 ml，然后充入氮?dú)? min，蓋好水解罐,將罐放入密封裝置中,擰緊密封裝置；將密封裝置于微波消解爐中，接上溫度傳感器，在160℃、800 W下,水解8 min；在160℃、600 W下，水解15 min。當(dāng)溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解罐，將水解杯從水解罐中逐一取下，用水轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中,過0.22 μm濾膜后供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 色譜條件

Agilent poroshell 120 HILIC-Z色譜柱(2.1×100)mm，2.7 μm,美國安捷倫科技公司；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：2 μl；流速：800 μl/min；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：正模式：4 000 V；負(fù)模式：3 500 V；干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：13 L/min；霧化氣壓力40 pa；掃描方式、監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)和其他參考條件參見表2。

2 討論

2.1 方法條件的優(yōu)化

2.1.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為了提高試驗(yàn)效率，采用微波消解的方法替代氨基酸的常規(guī)水解法，通過多次與常規(guī)水解法的比較，在10 min升溫到160℃保持20 min條件下，效果可以達(dá)到要求。變異系數(shù)均小于8.0%，說明本研究測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定，從T統(tǒng)計(jì)值看均小于T0.05,4(2.78)說明兩方法無顯著差異，檢測(cè)結(jié)果見表3。

表2 氨基酸質(zhì)譜參數(shù)

表3 飼料中氨基酸常規(guī)水解法與微波水解法比較結(jié)果(n=6)

2.1.2色譜柱的選擇

由于部分氨基酸的極性較大，在普通的C18反相色譜柱上的保留較差，因此在復(fù)雜的樣本基質(zhì)中，采用C18柱直接分離定量比較困難。本研究采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱進(jìn)行分離，在本研究的梯度洗脫下能夠?qū)⒘涟彼岷彤惲涟彼嵊行Х蛛x，滿足定性和定量的要求。標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的總離子和特征離子質(zhì)譜圖(MRM)

2.1.3流動(dòng)相的優(yōu)化

為了盡可能實(shí)現(xiàn)基線分離，提高靈敏度，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)16種氨基酸的目的，必須對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)采用了甲醇-水和乙腈-水2種常用的流動(dòng)相，為提高氨基酸的離子化效率，分別在水相和有機(jī)相中加入10%的200 mmol/L甲酸銨水溶液。為提高亮氨酸和異亮氨酸的分離度，采取改變200 mmol/L甲酸銨水溶液的pH值，分別用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0和5.0進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在pH值為3.0時(shí)，亮氨酸和異亮氨酸的分離度為1.52，分離效果見圖2。滿足方法學(xué)定量要求。在表1流動(dòng)相梯度的條件下，運(yùn)行時(shí)間為16 min，能夠?qū)崿F(xiàn)大部分氨基酸的基線分離。

圖2 亮氨酸和異亮氨酸的分離情況圖

2.2 方法性能

2.2.1線性范圍和靈敏度

在本方法試驗(yàn)條件下，通過對(duì)氨基酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)樣濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在(0.012 5～0.25)mmol/L內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)能夠檢測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉的最低含量，確定本試驗(yàn)的最低檢出限和定量限。本試驗(yàn)的線性回歸方程、線性系數(shù)、檢出限和定量限見表4。

表4 16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系和檢測(cè)限

2.2.2準(zhǔn)確度和精密度

在本研究的試驗(yàn)條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉(GBW(E)100010)進(jìn)行測(cè)定，以小麥粉的標(biāo)準(zhǔn)值為添加量計(jì)算回收率；重復(fù)6次，考察方法的精密度。具體結(jié)果見表5。樣品加標(biāo)回收率79.3%～123.5%，RSD≤7.56%,為了進(jìn)一步考察方法的準(zhǔn)確性，對(duì)同一魚粉樣品采用本研究與國標(biāo)《飼料中氨基酸的測(cè)定》GB/T 18246—2000進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)偏差小于7.56%，具體檢測(cè)結(jié)果見表6。由此可見，方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表6 本研究檢測(cè)數(shù)據(jù)與國標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)比較

3 結(jié)論

本研究為飼料中氨基酸的檢測(cè)提供一種新的途徑，在特定的環(huán)境條件下，可作為氨基酸檢測(cè)的選擇，該方法準(zhǔn)確度和精密度較好,操作較為簡單，檢測(cè)所用時(shí)間短，能夠適用于飼料中氨基酸的測(cè)定。