STX6在肝細胞癌預后評估中的作用

廖揚靜 關衛(wèi)兵 張炯善 肖閣敏 楊宏志

【摘要】目的 探討突觸融合蛋白6（STX6）表達水平與肝細胞癌（肝癌）患者臨床病理參數的關系，評估STX6在肝癌預后評估中的價值。方法 通過TCGA公共數據庫獲得371例肝癌組織和肝癌旁組織STX6的表達數據及臨床資料，分析STX6在肝癌組織及肝癌旁組織中的表達差異及對肝癌患者的預后影響。使用實時定量PCR檢測58例肝癌患者的新鮮冷凍腫瘤組織樣本及肝癌旁組織的STX6 mRNA表達水平。采用蛋白免疫印跡法檢測8例肝癌患者的腫瘤組織和肝癌旁組織、正常肝細胞LO2和7種人肝癌細胞系細胞STX6蛋白表達差異，免疫組織化學染色（免疫組化）法觀察肝癌患者的腫瘤組織和肝癌旁組織STX6蛋白染色差異，根據STX6 mRNA表達水平分為STX6低表達組與STX6高表達組，分析肝癌患者STX6 mRNA表達與臨床病理參數和肝癌生存預后的關系，并建立Cox回歸模型判斷STX6對肝癌患者預后的影響。結果 TCGA數據庫的基因芯片及臨床數據分析顯示，371例肝癌組織的STX6 mRNA表達水平高于肝癌旁組織（P < 0.001），并且肝癌組織STX6 mRNA表達水平隨腫瘤臨床分期（Ⅰ ～ Ⅲ期）及病理分期（G1 ～ G3期）升高而升高（總體及組間兩兩比較P均< 0.05），STX6高表達組肝癌患者總生存率低于STX6低表達組（P < 0.05）。58例肝癌組織中STX6 mRNA表達水平高于肝癌旁組織（P < 0.05）。進一步分析顯示，STX6高表達者的腫瘤分化程度較低、腫瘤較大、美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期較高（P均< 0.05）。蛋白免疫印跡顯示，肝癌組織中STX6蛋白表達較肝癌旁組織升高（8例標本中有6例提示高表達）。7種不同肝癌細胞系細胞中的STX6蛋白表達均較人正常肝細胞升高。免疫組化也顯示STX6在肝癌組織中的表達高于肝癌旁組織，并且主要在細胞質中表達。STX6高表達組肝癌患者的整體生存率低于低表達組（P = 0.039）。Cox回歸分析顯示，AJCC腫瘤分期（HR = 5.454，95%CI 1.825 ～ 16.297，P = 0.002）和STX6 mRNA表達水平（HR = 3.872，95%CI 1.641 ～ 9.140，P = 0.002）與肝癌術后總生存率密切相關。結論 STX6水平可以作為評估肝癌的預后分子標志物。

【關鍵詞】突觸融合蛋白6;肝細胞癌;預后

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression of syntaxin 6 （STX6） and clinicopathological parameters of patients with hepatocellular carcinoma （HCC）， aiming to evaluate the value of STX6 in predicting the clinical prognosis of these patients. Methods The STX6 expression level and clinical data of 371 HCC patients and matched tissues surrounding hepatoma were obtained from TCGA public database. The STX6 expression levels between HCC and tissues surrounding hepatoma were analyzed and its prognostic value for HCC patients was evaluated. Next， the expression levels of STX6 mRNA in the fresh frozen HCC tissues and tissues surrounding hepatoma from 58 HCC patients were quantitatively detected by real-time quantitative PCR. The expression levels of STX6 protein in the HCC and tissues surrounding hepatoma from 8 HCC patients， normal liver cell LO2 and 7 types of human liver cancer cell lines were detected by Western blot. The staining of STX6 protein in the HCC and tissues surrounding hepatoma was assessed by immunohistochemistry. All patients were divided into STX6 low-and high-expression groups according to the expression of STX6 mRNA. The relationship between STX6 mRNA expression and clinicopathological parameters and clinical prognosis of HCC was analyzed. Finally， a Coxs regression model was established to determine whether STX6 could be used as an independent factor affecting the clinical prognosis of HCC patients. Results TCGA database demonstrated that the expression levels of STX6 mRNA in the HCC tissues were significantly higher compared with those in the tissues surrounding hepatoma （all P < 0.001）. The expression level of STX6 mRNA was significantly up-regulated along with the clinical staging （stage Ⅰ-Ⅲ） and pathological staging （stage G1-G3） （all P < 0.05）. The overall survival （OS） of patients with higher STX6 expression was significantly shorter compared with their counterparts with lower STX6 expression （P < 0.05）. The expression level of STX6 mRNA in the HCC tissues was significantly higher than that in the tissues surrounding hepatoma （P < 0.05）. Patients with higher STX6 expression presented with lower tumor differentiation grade， larger tumor size and higher AJCC cancer staging （all P < 0.05）. Western blot showed that the expression of STX6 protein in the HCC tissues was up-regulated than that in the tissues surrounding hepatoma （6 of 8 cases with high expression）. The expression levels of STX6 protein in 7 types of human liver cancer cell lines were up-regulated than that in hepatocyte line LO2. Immunohistochemistry indicated that the expression of STX6 in the HCC tissues was higher than that in tissues surrounding hepatoma， primarily expressed in the cytoplasm. The OS of HCC patients with higher STX6 expression was remarkably shorter than that of those with lower STX6 expression （P = 0.039）. Coxs regression analysis showed that AJCC cancer staging （HR = 5.454， 95%CI 1.825-16.297， P = 0.002） and expression of STX6 mRNA （HR = 3.872， 95%CI 1.641-9.140， P = 0.002） were significantly correlated with postoperative OS of HCC patients. Conclusion STX6 expression level can serve as an independent prognostic factor for HCC patients.

【Key words】Syntaxin 6;Hepatocellular carcinoma;Prognosis

根據全球癌癥統計數據顯示，肝細胞癌（肝癌）是2018年全球第六大最常見的惡性腫瘤，也是世界上第四致命的惡性腫瘤[1]。在2015年，中國大約有466 100例新的肝癌病例發(fā)生，死亡病例約達422 100例[2]。盡管外科手術技術和綜合治療方法不斷改進，但肝癌的預后仍不盡如人意。近年來，肝癌分子標志物的發(fā)現和應用加深了我們對肝癌發(fā)病機制的認識。但是，目前尚沒有顯著有效的生物標志物用于肝癌分子靶向治療。突觸融合蛋白6（STX6）是可溶性N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子附著蛋白受體（SNARE）蛋白家族的一員，可通過參與多種腫瘤相關蛋白的囊泡運輸，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前已有多項研究顯示STX6在腎細胞癌、食管鱗狀細胞癌（ESCC）等多種腫瘤組織中明顯高表達，STX6已被證實為潛在的致癌基因。然而STX6與肝癌的關系尚未有相關研究報道，為此，本研究分析STX6在肝癌組織和細胞中的蛋白及mRNA表達水平，探討STX6的表達與肝癌患者臨床病理參數的關系，評估STX6在肝癌預后評估中的價值。

材料與方法

一、標本來源

58例肝癌組織和癌旁正常肝組織標本來源于中山大學附屬第三醫(yī)院2003年1月至2007年12月行肝癌手術切除術的患者，其中男53例、女5例，年齡（52±9）歲，隨訪時間2個月 ～ 9年。患者的手術日期至最后隨訪時間或死亡時間的時間長度作為患者的生存時間。

二、肝癌大樣本數據的獲取

通過美國腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫下載371例肝細胞癌患者STX6表達數據及臨床資料，并比較該大樣本數據中腫瘤組織和肝癌旁組織STX6 mRNA表達水平，分析STX6轉錄水平與臨床病理特征的相關性。最后以STX6 mRNA表達量的中位值將肝癌患者分為STX6高表達組和STX6低表達組，分析STX6對肝癌患者的預后價值。

三、 細胞系和細胞培養(yǎng)

研究中所用到的細胞系包括人正常肝細胞LO2，人肝癌細胞系[HepG2（G2）、Huh7（Huh）、Hep3B（3B）、Bel7404（7404）、MHCC97H（97H）、SMMC7721（7721）、QGY7703（QGY）]，均購于中國科學院細胞庫，LO2細胞和其他人肝癌細胞系培養(yǎng)分別使用Gibco?RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（Invitrogen公司），添加10%胎牛血清（Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素（Invitrogen公司），于37℃、5%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞在80%～90%融合后傳代培養(yǎng)。

四、蛋白免疫印跡法

本研究使用蛋白免疫印跡法檢測了8例肝癌患者中腫瘤組織和肝癌旁組織STX6表達差異，操作如下：①蛋白提取按照全蛋白提取試劑盒（KGP250;凱基生物）說明書進行肝癌組織和肝癌細胞的蛋白提取。并采用BCA試劑盒（BCA-23225;凱基生物）測定蛋白濃度，蛋白放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?②電泳采用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（KGP113;凱基生物）制備10%的分離膠和濃縮膠，上樣待測樣品和分子量標志物Marker，先在60 ～ 90 V電壓下電泳至分離膠，改換120 V電壓下至電泳結束;③轉膜，恒流300 mA條件下，轉膜1.5 h;④檢測目的蛋白，采用磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜3次后，孵育STX6抗體（ab140607;Abcam公司）置于4 ℃環(huán)境過夜。洗膜3次，室溫下孵育二抗（KGAA35;凱基生物）1 h。洗膜3次，于暗室進行曝光顯影，分析目的蛋白的相對表達量。

五、免疫組織化學染色（免疫組化）

按照Dako免疫組化試劑盒（K5007;Dako）說明書中步驟進行STX6染色，在顯微鏡下觀察肝癌組織和肝癌旁組織的染色結果差異。

六、實時定量PCR

使用RNA快速提取試劑盒（RN001;奕杉生物）提取58例新鮮冷凍肝癌組織樣本及肝癌旁組織樣本的總RNA，并使用Roche Tra-nscriptor cDNA Synth.Kit2逆轉錄試劑盒將上述RNA逆轉錄成模板DNA。β-actin作為對照管家基因。引物如下：STX6上游5-AGAGCAAGAGGGTTCTGCATTG-3，下游5-TGGTACAGCAACATCAAGTCGG-3，β-actin上游5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3，下游5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3。Roche SYBR Green試劑作為通用染料進行實時熒光定量PCR檢測。冰上避光用96孔板配制PCR反應體系（總體積10 μl）：DEPC水3 μl，SYBR Green I Master 5 μl，STX 6及β-actin上游引物各0.5 μl、下游引物各0.5 μl。將96孔板于Roche LightCycler? 480 PCR儀中進行反應，設置程序為： 95℃ 5 min，然后95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s循環(huán)40次，最后95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃ 5 min、40℃ 10 s。采用2-△△Ct方法分析組織樣本間STX6 mRNA相對表達量。計算公式：2-△△Ct，△Ct = CtSTX6-Ctβ-actin。以STX6 mRNA表達量的中位值，將肝癌患者分為STX6高表達組和STX6低表達組。

七、統計學處理

應用SPSS 22.0處理數據。計量資料以表示，肝癌組織及肝癌旁組織的表達差異采用配對t檢驗，低表達組與高表達組的比較采用成組t檢驗，不同臨床分期及病理分期間的表達差異采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計量資料以例（%）表示，無序分類資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法;等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。構建Kaplan-Meier生存分析模型評估STX6高表達組和低表達組的生存率，組間比較采用log-rank檢驗，最后通過Cox回歸分析肝癌患者預后的影響因素，其中多因素回歸分析采用Forward LR法。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、TCGA數據庫的基因芯片及臨床數據分析

371例肝癌的STX6 mRNA表達水平高于肝癌旁組織（P < 0.001），并且肝癌患者STX6 mRNA表達水平隨腫瘤臨床分期（Ⅰ ～ Ⅲ期）及病理分期（G1 ～ G3期）升高而升高（總體及組間兩兩比較P均< 0.05），肝癌患者STX6 mRNA表達水平在腫瘤臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期及病理分期G3期和G4期間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。以STX6 mRNA表達水平的中位值為臨界值，將肝癌患者分為STX6高表達組和STX6低表達組，Kaplan-Meier分析顯示，STX6 mRNA高表達組肝癌患者總生存率低于STX6 mRNA低表達組（P = 0.012），見圖1。

二、肝癌組織和肝癌旁組織分析結果

58例肝癌組織中STX6 mRNA表達水平高于肝癌旁組織（P = 0.001），見圖1A。進一步分析顯示，STX6高表達組的腫瘤分化程度較低、腫瘤較大、美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期較高（P 均< 0.05），見表1。蛋白免疫印跡顯示，肝癌組織中STX6蛋白表達較肝癌旁組織升高（8例標本中有6例提示高表達），見圖2B;在7種不同肝癌細胞系細胞中的STX6蛋白表達均較人正常肝細胞（LO2）升高，見圖2C。免疫組化也顯示STX6在肝癌組織中的表達高于肝癌旁組織，并且主要在細胞質中表達，見圖2D。以STX6免疫組化結果將58例患者分為STX6高表達組和STX6低表達組，通過Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，結果顯示STX6高表達組肝癌患者的整體生存率低于低表達組（P = 0.039），見圖2E。

三、STX6的表達與肝癌患者的預后密切相關

單因素Cox回歸分析顯示，肝癌切除術后總生存率的影響因素包括腫瘤分化程度、腫瘤大小、AJCC腫瘤分期以及STX6 mRNA表達水平（P均< 0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，AJCC腫瘤分期（HR = 5.454，95%CI 1.825 ～ 16.297，P = 0.002）和STX6 mRNA表達水平（HR = 3.872，95%CI 1.641 ～ 9.140，P ?= 0.002）與肝癌術后總生存率密切相關，見表2。

討論

2018年全球新增原發(fā)性肝癌高達841 000例[1]。我國原發(fā)性肝癌新增病例達全球新增病例半數以上。肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管在預防、診斷和治療方面都取得了進步，但發(fā)病率和病死率仍在繼續(xù)上升[3]。大多數肝癌患者的早期臨床表現不明顯，確診時間較晚，且通過手術治療效果不佳，復發(fā)率較高。肝移植雖然是有效的治療手段，但國內供體缺乏，所以目前肝癌的治療效果仍不盡如人意[4-5]。免疫治療為肝癌治療提供了新的方向，但目前相關臨床試驗有限且存在并發(fā)癥，其療效有待進一步研究驗證[6]。因此，深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，探究新的肝癌分子標志物以提高肝癌的診治水平顯得尤為重要。

可溶性NSF附著蛋白受體（SNARE）是參與囊泡運輸的一類膜蛋白，在囊泡運輸過程中，SNARE復合物可以將囊泡和靶區(qū)室膜錨定在一起，從而促進囊泡和靶膜融合[7-8]。STX6是SNARE蛋白家族的一員，主要存在于反式高爾基體膜上，調節(jié)多種細胞內膜轉運活動，如內吞作用、循環(huán)、順行和逆行轉運[9-10]。例如，STX6可參與整合素的傳遞和整合素引發(fā)的黏附斑激酶的激活[11]。整合素屬于細胞黏附受體，它可作為信號分子、細胞機械傳感器和細胞遷移中的關鍵分子，參與惡性腫瘤從原發(fā)到侵襲轉移的過程[12-14]。有研究顯示，STX6可作為p53家族（p53、p63和p73）潛在的靶點，是p53家族調控細胞黏附和細胞存活的效應體。STX6敲低后可抑制細胞黏附，并導致細胞周期停滯和細胞凋亡，而且下調p53表達可以減弱STX6敲低后對人乳腺癌細胞（MCF7）增殖的抑制效果[15]。此外，有報道抑制STX6功能可干擾血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）向質膜的運輸，并促進了VEGFR2在溶酶體降解，從而減少血管內皮生長因子（VEGF）誘導的腫瘤細胞增殖、細胞遷移和血管形成[16]?？梢奡TX6在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要角色。

目前已有相關研究表明STX6與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯系。Du等[17]的研究顯示，STX6在食管癌組織中高表達，沉默食管癌細胞STX6表達可通過p53依賴的方式抑制食管癌細胞的存活和增殖，并且通過抑制整合素的運輸進而抑制食管癌細胞的遷移。在腎細胞癌中STX6蛋白表達明顯升高，且沉默STX6后腎癌ACHN細胞活力降低[18]。此外，有研究顯示STX6可調控化學治療耐藥相關分子的儲存和運輸，在前列腺癌耐恩雜魯胺細胞株（C4‐2B）中STX6以及外泌體高表達，敲低STX6后前列腺癌細胞外泌體分泌下降，并且增加了前列腺癌細胞對恩雜魯胺的敏感度，提高前列腺癌的化學治療效果[19]。在人卵巢癌細胞系A2780細胞中，STX6和囊泡相關膜蛋白4與P型ATP酶膜蛋白共定位，有助順鉑從高爾基體到質膜的分泌性囊泡運輸，從而增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[20]。因此，STX6可受關鍵癌基因的調控，調節(jié)腫瘤相關分子的胞內運輸，以及通過介導胞外泌體分泌促進耐藥而參與疾病的進展。本研究中，STX6在肝癌組織及肝癌細胞系細胞中高表達，并且高表達STX6患者的預后較低表達STX6患者差，STX6不僅與肝癌患者臨床病理參數（例如腫瘤大小、AJCC臨床分期、腫瘤分化程度）等密切相關，還與肝癌患者的生存預后密切相關。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-03-15）

（本文編輯：林燕薇）