劉頂鼎 楊菁 劉冬 郭建生 毛效賢 曾貴榮 周英

摘 要 目的：研究芎麻湯提取物對肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-羥色胺（5-HT）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP） 的影響。方法：將50只雄性自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠按血壓隨機分為模型對照組、正天丸陽性對照組（1.6 g/kg）和芎麻湯提取物低、中、高劑量組（4.5、9.0、18.0 g/kg，以生藥量計），每組10只;并另取10只正常大鼠作為正常對照組。給藥組大鼠分別灌胃相應藥物，每天1次，連續(xù)28 d;正常對照組和模型對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水。末次給藥后，除正常對照組外，其余各組大鼠均采用電刺激三叉神經(jīng)節(jié)（10 min）法復制肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛大鼠模型，并于造模后再維持給藥1次。30 min后，觀察大鼠一般行為學及舌質(zhì)情況，測定大鼠血壓，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠腦組織中5-HT、CGRP含量，并采用Western blot法測定大鼠腦組織中CGRP蛋白表達水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠出現(xiàn)眼結(jié)膜顏色加深變紅、過度理毛、甩頭等行為學變化，大部分大鼠舌質(zhì)紫暗，并且其收縮壓和腦組織中CGRP含量及蛋白表達水平均明顯升高（P<0.05或P<0.01），腦組織中5-HT含量顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，各給藥組大鼠的上述行為學變化及舌質(zhì)變化均明顯改善;正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物高劑量組大鼠收縮壓、腦組織中CGRP含量及蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）;正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物中、高劑量組大鼠腦組織中5-HT含量顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：芎麻湯提取物對肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型大鼠有明顯的保護作用，其機制可能與降低腦組織中CGRP含量、升高腦組織中5-HT含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 芎麻湯提取物;肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型;自發(fā)性高血壓大鼠;5-羥色胺;降鈣素基因相關(guān)肽

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0024-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of the extract of Xiongmatang on 5-HT and CGRP in brain tissue of rats with liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine. METHODS： Fifty male spontaneously hypertension （SHR） rats were randomly divided into model control group， Zhengtian pill positive control group （1.6 g/kg）， the extract of Xiongmatang low-dose， medium-dose and high-dose groups （4.5， 9.0， 18.0 g/kg， by crude drug）， with 10 rats in each group. Another 10 normal rats were taken as normal control group. Administration group was given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 d. Normal control group and model control group were given equal volume normal saline intragastrically. After last administration， except for normal control group， other groups were used to stimulate trigeminal ganglia （10 min） to establish liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model， and maintained the administration once more after making the model. 30 min later， general behavior and tongue quality of rats were observed， and the blood pressure was measured; the contents of 5-HT and CGRP in cerebral tissue of rats were determined by ELISA. The protein expression of CGRP in cerebral tissue of rats were determined by Western blot method. RESULTS： Compared with the normal control group， the rats in the model control group had behavioral symptoms， such as the color of conjunctiva deepened and reddened， excessive hairdressing， head flicking， and most of the rats had purple tongue; the systolic pressure and the content and protein expression of CGRP were all increased obviously （P<0.05 or P<0.01）， while the content of 5-HT in cerebral tissue was decreased obviously （P<0.01）. Compared with model control group， general behavior and tongue quality of rats were improved significantly in administration groups. Systolic pressure， the content and the protein expression of CGRP in cerebral tissue of rats were decreased significantly in Zhengtian pill positive control group and the extract of Xiongmatang high-dose group （P<0.05）， while the content of 5-HT? in cerebral tissue of rats were increased significantly in Zhengtian pill positive control group， the extract of Xiongmatang medium-dose and high-dose groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： The extract of Xiongmatang has obvious protective effect on liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model rats， the mechanism of which may be associated with reducing the content of? CGRP in cerebral tissue and raising the content of 5-HT in cerebral tissue.

KEYWORDS? ?Extract of Xiongmatang; Liver-yang hyperactivity and blood stagnation migraine model; Spontaneously hypertension rats; 5-HT; CGRP

偏頭痛是一種臨床常見的神經(jīng)性疾病，其特征是由神經(jīng)血管功能障礙引起的周期性頭痛。2017年《Lancet》雜志發(fā)表的世界衛(wèi)生組織（WHO）2015年全球疾病負擔調(diào)查的研究結(jié)果表明，偏頭痛為人類第六位常見疾病，按失能所致生命損失（Years of life lost to disability，YLDs）計算，偏頭痛為第二位致殘性疾病[1]。偏頭痛病因復雜，發(fā)病機制尚無明確定論。由Moskowitz M提出的三叉神經(jīng)血管反射學說是目前的主流學說，其認為神經(jīng)源性炎癥反應是偏頭痛發(fā)病機制的基礎(chǔ)，5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）等血管活性物質(zhì)含量的異常變化及降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、P物質(zhì)（SP）等神經(jīng)遞質(zhì)的異常分泌，在神經(jīng)源性炎癥反應的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2]。目前，基于三叉神經(jīng)血管反射學說的模型一般認為有三叉神經(jīng)節(jié)刺激模型、硬腦膜神經(jīng)源性炎癥模型、硝酸甘油動物模型等[3]。

偏頭痛屬中醫(yī)“頭風”范疇，《中藥新藥臨床指導原則（試行）》中根據(jù)中醫(yī)證候診斷標準，將偏頭痛分為肝陽上亢頭痛證、瘀血頭痛證、痰濁頭痛證、腎虛頭痛證、氣血虧虛頭痛證五個證候[4]。經(jīng)長期臨床觀察，單一病機導致頭痛的很少，常有2～3個病機的夾雜因素，在諸多因素中瘀血阻絡(luò)、肝陽上亢為偏頭痛發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-7]。中醫(yī)辨證論治也多以活血、平肝、祛風三法為本病主要治療方法[5-9]。偏頭痛瘀血挾肝陽上亢證，癥見頭痛日久如刺或脹，痛有定處，或心煩易怒，目赤，口苦;或面紅，口干，舌質(zhì)紫暗，或有瘀斑、瘀點等[4]。但目前的實驗研究中，暫無相對應的肝陽上亢兼偏頭痛瘀血動物模型研究。

芎麻湯源于《圣濟總錄》之大芎丸，《本草綱目》稱其為天麻丸，《醫(yī)宗金鑒》將丸劑改成湯劑，定名“芎麻湯”。芎麻湯由天麻、川芎組成，具有平肝、活血、通絡(luò)止痛之功，主治偏頭痛、頭風眩暈、身體拘倦，在臨床上尤擅于治療肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芎麻湯對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠的改善作用明顯，能有效減輕模型大鼠行為學癥狀，其作用機制與調(diào)節(jié)偏頭痛模型大鼠血漿中5-HT、CGRP含量和降低三叉神經(jīng)頸髓復合體（TCC）中5-HT、CGRP表達等有關(guān)[11-16]。高血壓屬于中醫(yī)“風?！狈秶徱黄糩17]研究發(fā)現(xiàn)，平肝潛陽、清熱活血藥物對高血壓具有較好的降壓作用，并認為肝陽上亢與高血壓病關(guān)系密切?！堆C論》說：“世謂血塊為瘀，清血非瘀;黑色為瘀，鮮血非瘀;此論不確。蓋血初離經(jīng)，清血也，鮮血也，然即是離經(jīng)之血，雖清血鮮血，亦是瘀血”[18]，因此中醫(yī)認為“離經(jīng)之血即為瘀”?；谇捌谘芯炕A(chǔ)及以上中醫(yī)理論，本研究擬采用電刺激自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠復制肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型，并以具有疏風活血、養(yǎng)血平肝、通絡(luò)止痛功效的中成藥正天丸為陽性對照，方證對應觀察芎麻湯提取物對肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT、CGRP的影響，探討其治療肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

TD4低速離心機（南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司）;MR-96A酶標儀（深圳邁瑞科技有限公司）;LABOSPECT003自動生化分析儀（日本日立公司）;DYY-Ⅲ-40B轉(zhuǎn)移電泳槽（北京六一儀器廠）;WH-985-C8翻轉(zhuǎn)振蕩器（太倉市科教器材廠）;TS.B-108往復式脫色搖床（美國Qilinbeier公司）;BP-100A全自動大小鼠無創(chuàng)血壓系統(tǒng)（成都泰盟生物科技有限公司）;HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

川芎飲片（產(chǎn)地：四川，批號：17031104）和天麻飲片（產(chǎn)地：貴州，批號：17052001）均購自老百姓大藥房連鎖股份有限公司東塘店，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院郭建生教授鑒定分別為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖和蘭科植物天麻（Gastrodia elata Blume.）的干燥塊莖;正天丸（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：160324，規(guī)格：6 g）;大鼠5-HT 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、大鼠CGRP ELISA試劑盒（美國AD公司，批號：160322、170813）;兔抗CGRP抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（美國KPL公司，批號：170519、170612、170322）;小鼠β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Proteintech公司，批號：60008-1-Ig）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、電化學發(fā)光（ECL）顯色試劑盒、RIPA裂解液（上海生工生物工程股份有限公司，批號：170818、CS06668- 0050、A610425- 0005）;其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SHR大鼠50只、SD大鼠10只，♂，SPF級，體質(zhì)量220～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2014-0012。大鼠購入后飼養(yǎng)在新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室中的SPF級動物實驗室內(nèi)，所有動物實驗研究均符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導原則。實驗期間環(huán)境溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%。

2 方法

2.1 芎麻湯提取物的制備

取川芎200 g、天麻50 g，加水1 000 mL浸泡2 h，煎煮2次，每次煎煮保持微沸30 min，合并濾液，水浴濃縮得到140 g浸膏，得率為56%。

2.2 造模與分組

將50只SHR大鼠按血壓隨機分為5組，分別為模型對照組、正天丸陽性對照組（1.6 g/kg，根據(jù)成人臨床劑量換算而得的等效劑量）和芎麻湯提取物低、中、高劑量組（4.5、9.0、18.0 g/kg，以生藥量計，分別根據(jù)臨床用量換算而得的等效劑量的1、2、4倍劑量）;另取10只SD大鼠作為正常對照組。各給藥組大鼠分別灌胃相應藥物，正常對照組和模型對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥4周（28 d）。實驗第29天，除正常對照組外，其余各組大鼠均參照Pei P等[19]、朱玉璞等[20]報道的方法造模：以2%戊巴比妥鈉（2.0 mL/kg）腹腔注射麻醉后將大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上，剃除兩眼到兩耳之間的毛發(fā)，用碘酒消毒，逐層切開皮膚、肌肉，暴露顱骨。在前囟點后3.2 mm，旁開2.8 mm處（右邊）用牙科鉆插孔，將刺激電極插入三叉神經(jīng)節(jié)，深度為硬腦下9.3～9.5 mm，術(shù)后持續(xù)麻醉。電極刺激參數(shù)為周期200 ms、波寬5 ms、幅度10 V，連續(xù)刺激10 min。待大鼠清醒后，各組大鼠再次灌胃對應藥物。

模型成功評價標準：以大鼠雙眼結(jié)膜顏色加深變紅，易激惹，頻繁打斗，提尾時尖叫、驚跳甚至咬人等行為學變化及血壓升高，為肝陽上亢證建立成功的觀察標準[17，21];以電刺激大鼠時出現(xiàn)咀嚼肌收縮、口鼻分泌物增多的癥狀，清醒后大鼠節(jié)律性抖動頭部、過度理毛、甩頭、扭頭等行為學表現(xiàn)[19-20]及舌質(zhì)紫暗，或有瘀斑、瘀點[22]為瘀血型偏頭痛建立成功的觀察標準。

2.3 一般情況觀察

電刺激時，觀察大鼠是否出現(xiàn)咀嚼肌收縮、口鼻分泌物增多的癥狀;電刺激結(jié)束待大鼠清醒后及末次給藥后30 min，均觀察其一般行為學癥狀及舌質(zhì)情況，以判定模型是否建立成功。

2.4 血壓測定

末次給藥后30 min，分別采用尾動脈搏動法測定各組大鼠血壓（1 mmHg≈133.322 Pa）。

2.5 腦組織中5-HT、CGRP含量測定

血壓測定后，將大鼠處死，解剖取其腦組織，以1 g腦組織加入2 mL生理鹽水的比例進行勻漿，然后以? ? ?3 000 r/min離心10 min，取上清液，參照ELISA試劑盒說明書操作檢測腦組織勻漿中5-HT、CGRP含量。

2.6 腦組織中CGRP蛋白表達測定

采用Western blot 法檢測腦組織CGRP蛋白表達。取各組大鼠腦組織50 ?g，9 g/L氯化鈉溶液沖洗后加入10 ?L細胞裂解液，冰上裂解1 h，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取組織提取液行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，然后在100 V 、4 ℃轉(zhuǎn)移2 h至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上;以含5%脫脂奶粉、聚山梨酯20的磷酸鹽緩沖液（PBS）（PBST緩沖液）室溫孵育2 h，加入封閉液稀釋的一抗（1 ∶ 200），室溫孵育2 h，0.1% Triton-PBS溶液洗膜3次，10 min/次;加入封閉液稀釋的二抗（1 ∶ 2 000），室溫孵育1 h，0.1% Triton-PBS洗膜3次，10 min/次;參照試劑盒說明書進行ECL檢測液顯色、X光膠片顯影定影，并采用Image J 2x軟件檢測條帶灰度值，CGRP蛋白的相對表達強度=CGRP條帶灰度值/內(nèi)參β-actin條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用x±s表示，若資料符合正態(tài)分布且方差齊時，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗;若資料呈非正態(tài)分布或（和）方差不齊時，先進行變量變換后再采用單因素方差分析和t檢驗進行比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 芎麻湯提取物對大鼠一般行為學的影響

電刺激時大鼠均出現(xiàn)咀嚼肌收縮、口鼻分泌物增多的癥狀。大鼠清醒后，與正常對照組比較，模型對照大鼠均出現(xiàn)雙眼結(jié)膜顏色加深變紅，易激惹，頻繁打斗，提尾時尖叫、驚跳甚至咬人，節(jié)律性抖動頭部、過度理毛、甩頭、扭頭等行為學表現(xiàn)，并且多數(shù)大鼠舌質(zhì)紫暗，少數(shù)大鼠有明顯瘀斑或瘀點，這提示肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型建立成功。給藥后，正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物各劑量組大鼠以上癥狀均明顯好轉(zhuǎn)，個別大鼠以上癥狀甚至完全消失。

3.2 芎麻湯提取物對模型大鼠收縮壓的影響

首次給藥前：與正常對照組比較，模型對照組大鼠收縮壓顯著升高（P<0.01）;與模型對照組比較，正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物各劑量組均無明顯差異（P>0.05）。末次給藥后：與正常對照組比較，模型對照組大鼠收縮壓顯著升高（P<0.05）;與模型對照組比較，各給藥組大鼠收縮壓均不同程度降低，正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物高劑量組大鼠收縮壓差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組大鼠收縮壓測定結(jié)果見表1。

3.3 芎麻湯提取物對模型大鼠腦組織中5-HT、CGRP含量的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦組織中5-HT含量顯著降低（P<0.01），CGRP含量顯著升高（P<0.01）。與模型對照組比較，正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物中、高劑量組大鼠腦組織中5-HT含量顯著升高（P<0.05），正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物高劑量組大鼠腦組織中CGRP含量顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腦組織中5-HT、CGRP含量測定結(jié)果見表2。

3.4 芎麻湯提取物對模型大鼠腦組織中CGRP蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦組織中CGRP蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型對照組比較，正天丸陽性對照組和芎麻湯提取物中、高劑量組大鼠腦組織中CGRP蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腦組織中CGRP蛋白表達的電泳圖見圖1，表達水平測定結(jié)果見表3。

4 討論

芎麻湯由天麻、川芎組成，方中天麻專入肝經(jīng)，息風平肝，通絡(luò)止痛，主治頭風頭痛;川芎為血中氣藥，主入肝、膽經(jīng)，行氣開郁，活血止痛，主治風冷頭痛眩暈等血瘀所致之疾，《日華子本草》載：“治一切風，一切氣，一切勞損，一切血，……破癥結(jié)宿血，養(yǎng)新血”。兩藥合用共奏平肝、活血、通絡(luò)止痛之功，在臨床上尤擅肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛的治療[9-10]。同時研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)西藥比較，芎麻湯能更好地緩解偏頭痛患者的臨床癥狀，減少頭痛發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時間[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠會出現(xiàn)雙眼結(jié)膜顏色加深變紅，易激惹，頻繁打斗，提尾時尖叫、驚跳，甚至咬人等一般行為學變化，以上變化與肝陽上亢證臨床表現(xiàn)極為相似[21]。電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)建立偏頭痛模型時，需要進行開顱手術(shù)，手術(shù)中會導致出血，中醫(yī)自古有“離經(jīng)之血即為瘀”“因瘀血為實邪，不通則痛”的說法，因此，模型大鼠除了會出現(xiàn)節(jié)律性抖動頭部、過度理毛、甩頭、扭頭等偏頭痛行為學表現(xiàn)外[19-20]，舌質(zhì)會由淡紅色變化為紫暗或有瘀斑、瘀點[22]?；谝陨侠碚撗芯浚菊n題組大膽提出采用電刺激SHR大鼠建立肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛大鼠模型。在預實驗中發(fā)現(xiàn)，電刺激SHR大鼠（♀♂各半）后，上述行為學癥狀及舌質(zhì)變化均與理論情況一致，說明造模成功。在偏頭痛的基礎(chǔ)研究上，為能得到穩(wěn)定的結(jié)果一般均選擇♂嚙齒類動物建立偏頭痛模型[24]，故本研究正式實驗時選擇♂大鼠為實驗動物。為方證對應驗證芎麻湯對肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛的作用，實驗中選用正天丸為陽性對照藥。正天丸是由川芎、鉤藤等15味中藥組成的中藥復方制劑，具有養(yǎng)血平肝、疏風活血、通絡(luò)止痛等功效，適用于治療中醫(yī)中瘀血阻絡(luò)、肝陽上亢等引起的多種頭痛和現(xiàn)代醫(yī)學中偏頭痛、神經(jīng)性頭痛等多種類型頭痛，是目前臨床治療偏頭痛的主要中成藥之一[25-26]。

本研究通過探索并成功建立了一種通過電刺激SHR大鼠復制肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型的“病證結(jié)合”造模方法。實驗結(jié)果顯示，復制的肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛大鼠除一般行為學癥狀及舌質(zhì)發(fā)生了明顯變化之外，腦組織中與偏頭痛發(fā)病機制密切相關(guān)的重要生化指標5-HT、CGRP含量變化情況，與李鳳金等[27]復制的硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠5-HT含量顯著降低、CGRP含量顯著升高的情況也一致，均說明造模成功。同時發(fā)現(xiàn)，芎麻湯提取物可改善肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型大鼠行為學癥狀及舌質(zhì)情況，可明顯降低其收縮壓，調(diào)節(jié)其腦組織5-HT含量的過度降低及CGRP含量的過度升高，下調(diào)其腦組織CGRP蛋白表達。方證對應的陽性對照藥正天丸也具有同樣的作用，與李濤等[28]對正天丸的研究結(jié)果一致，這說明芎麻湯提取物與肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛方證對應。但本實驗在研究過程中也存在不足之處：一是實驗組別設(shè)計時未設(shè)置模型空白對照組（僅開顱不電刺激），即假手術(shù)組，因此無法排除開顱手術(shù)對大鼠的影響;二是針對瘀血證僅用舌質(zhì)變化進行主觀評價，未檢測血液流變學參數(shù)等客觀評價指標，有影響實驗結(jié)果可靠性的風險?；诒狙芯拷Y(jié)果及經(jīng)驗總結(jié)，本課題組將在接下來的研究中進行改進，以更全面客觀地研究芎麻湯提取物對肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛的治療作用及作用機制。

本實驗結(jié)果能為肝陽上亢兼瘀血型偏頭痛模型的研究及芎麻湯的中醫(yī)臨床應用、分子水平上進一步的機制研究提供一定的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2019-09-15 修回日期：2019-11-16）

（編輯：林 靜）