紅茶菌中風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)功能微生物的研究進(jìn)展

檀馨悅，黎 琪，王 晴，李曉敏，張曉琳*

（中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

紅茶菌也被叫做康普茶、海寶或胃寶，是糖茶水經(jīng)酵母和細(xì)菌的共生菌群發(fā)酵而成的茶飲料，由發(fā)酵茶湯和漂浮在表面的菌膜組成，味道酸甜適口，具有獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味。紅茶菌已被證實(shí)具有保護(hù)肝臟、抗菌、抗氧化和抗癌等功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。據(jù)推測(cè)，這種茶飲料起源于公元前220年我國(guó)秦朝。公元414年，由日本醫(yī)生Kombu帶入日本，后陸續(xù)傳入俄羅斯、東歐和德國(guó)等地，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，現(xiàn)被稱(chēng)為“Kombucha tea”，中文音譯為康普茶[1-3]。近兩年，生物技術(shù)及其生產(chǎn)體系的不斷完善為紅茶菌的安全和規(guī)?；a(chǎn)提供了可能，因此，全球眾多飲料行業(yè)巨頭紛紛將目光轉(zhuǎn)向了這種市場(chǎng)占有率迅速提升的發(fā)酵茶飲料：星巴克旗下的Evolution Fresh推出了有機(jī)紅茶菌系列產(chǎn)品；可口可樂(lè)和百事公司也分別對(duì)主打紅茶菌的品牌MOJO和KeVita進(jìn)行了收購(gòu)。預(yù)計(jì)到2025年，國(guó)際紅茶菌飲料的市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到54.5億 美元。

紅茶菌的發(fā)酵過(guò)程促進(jìn)了其獨(dú)特風(fēng)味的形成，故而更能為消費(fèi)者帶來(lái)口感和風(fēng)味上的滿足感，但與所有發(fā)酵食品一樣，其品質(zhì)和風(fēng)味控制受到菌種和發(fā)酵工藝等因素的影響。已有研究證實(shí)，紅茶菌風(fēng)味物質(zhì)的形成、種類(lèi)和成分變化與組成紅茶菌的酵母和細(xì)菌總數(shù)及其種群動(dòng)態(tài)變化相關(guān)[4-5]。目前鮮有針對(duì)紅茶菌發(fā)酵微生物與其特定風(fēng)味物質(zhì)關(guān)系相關(guān)研究的歸納總結(jié)。本文通過(guò)分析紅茶菌中的常見(jiàn)微生物類(lèi)群及其在其他發(fā)酵食品中與食品風(fēng)味特征的關(guān)系，為開(kāi)展紅茶菌風(fēng)味品質(zhì)控制的優(yōu)勢(shì)微生物群落組成優(yōu)化提供參考。

1 紅茶菌微生物多樣性

參與紅茶菌發(fā)酵的微生物主要包括酵母、醋酸菌以及少量的乳酸菌，其種類(lèi)及豐度與紅茶菌樣品來(lái)源、氣候、地理位置和培養(yǎng)基質(zhì)等有關(guān)[6]。發(fā)酵過(guò)程中，酵母利用轉(zhuǎn)化酶將糖茶水中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，進(jìn)一步通過(guò)糖酵解產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。醋酸菌利用乙醇產(chǎn)生醋酸，將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸。共生菌群所產(chǎn)生的乙醇與醋酸能夠抑制致病菌的生長(zhǎng)，同時(shí)利用果糖與葡萄糖生產(chǎn)纖維素作為次級(jí)代謝產(chǎn)物。大量共生菌附著在纖維素網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的膠狀物上，形成了菌膠團(tuán)生物膜，并按容器的形狀不斷生長(zhǎng)變厚[6]。菌膜漂浮在茶水表面，便于附著的微生物獲得充足的氧氣，使其免受紫外線的傷害，并能加強(qiáng)酵母與細(xì)菌之間的共生作用（圖1）。

圖1 紅茶菌（拍攝于中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院）Fig. 1 Kombucha tea prepared in COFCO Nutrition and Health Research Institute

1.1 紅茶菌中酵母種類(lèi)及其對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味的影響

紅茶菌中酵母種類(lèi)較多[1,5,7-9]，目前紅茶菌中已知的部分酵母菌在各種酒類(lèi)、果汁及其他發(fā)酵食品中也有發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)酵食品的感官特征主要與發(fā)酵過(guò)程中酵母的代謝產(chǎn)物有關(guān)，包括醇、酯和酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。酵母發(fā)酵過(guò)程中，芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）、支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）和蛋氨酸在3 種酶（轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶和脫氫酶）的作用下通過(guò)Ehrlich路徑被轉(zhuǎn)化成高級(jí)醇，高級(jí)醇或乙醇在乙酰輔酶A作用下通過(guò)合成反應(yīng)產(chǎn)生酯類(lèi)化合物[10]。紅茶菌中酵母種類(lèi)及豐度差異導(dǎo)致其產(chǎn)生的風(fēng)味活性物質(zhì)種類(lèi)和成分也不盡相同。表1中列出了目前從紅茶菌中分離出的主要酵母種類(lèi)。

表1 紅茶菌中分離的酵母菌Table 1 Yeasts separated from Kombucha tea

1.1.1 接合酵母屬

目前研究發(fā)現(xiàn)在紅茶菌中存在的拜氏接合酵母和魯氏接合酵母多應(yīng)用于其他發(fā)酵類(lèi)產(chǎn)品。拜氏接合酵母在高糖分低pH值的發(fā)酵食品中廣泛存在。因其對(duì)酸耐受，易在發(fā)酵食品中繼續(xù)生長(zhǎng)，在食品行業(yè)常被認(rèn)為是腐敗菌，但近年來(lái)的研究表明拜氏接合酵母能通過(guò)酯化反應(yīng)產(chǎn)生多種酯類(lèi)化合物，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味形成具有積極作用[3,19]。Garavaglia等[20]利用拜氏接合酵母發(fā)酵葡萄酒能產(chǎn)生高水平的乙基酯，其與釀酒酵母混合發(fā)酵，使葡萄酒的香氣更濃郁飽滿。許焰[19]研究發(fā)現(xiàn)，與釀酒酵母MT1相比，拜氏接合酵母15不僅具有較高的產(chǎn)酸類(lèi)、酯類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)的能力，而且還能夠產(chǎn)生19 種特有的風(fēng)味化合物，包括2-庚醇、2-壬醇、壬醇、己醇、香葉醇、2-庚酮、丙酸和丁酸等。

魯氏接合酵母是一種常見(jiàn)的嗜高滲透壓酵母菌，其可利用淀粉產(chǎn)生糖類(lèi)生成乙醇，并伴隨高級(jí)醇、芳香雜醇類(lèi)和呋喃酮類(lèi)副產(chǎn)物的合成，是傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的重要增香微生物[21-23]。李志江等[24]利用魯氏接合酵母發(fā)酵豆醬，使豆醬中的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)增加了12 種，包括苯乙醇、甘油、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、異戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、三乙二醇二異辛酸酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、間十五烷基酚、甲基叔戊基醚和油酸酰胺。

1.1.2 假絲酵母屬

假絲酵母屬于產(chǎn)酯酵母，是產(chǎn)生酒類(lèi)和發(fā)酵飲品香味物質(zhì)的主要微生物之一[25]。在酒類(lèi)釀造中，將假絲酵母拌入酒醅中蒸餾或與紅曲、釀酒酵母共同發(fā)酵，能提高酒體中乙酸乙酯的含量，改善口味和香氣[26]。李藝凡等[27]采用克魯斯假絲酵母與其他酵母順序接種發(fā)酵赤霞珠紅葡萄酒，產(chǎn)生了法國(guó)酵母單菌發(fā)酵所不具有的獨(dú)特豐富復(fù)雜的香氣物質(zhì)，如苯乙醇、薄荷醇、檸檬烯、十一醛和肉豆蔻醛等。在茶葉發(fā)酵中，用近平滑假絲酵母發(fā)酵的普洱茶既保持了傳統(tǒng)風(fēng)味，又具有較明顯的乳酪香和甜香等獨(dú)特香味[28]。

1.1.3 酒香酵母屬

酒香酵母是紅茶菌中常見(jiàn)的酵母之一，也是比利時(shí)蘭比克啤酒自然發(fā)酵中產(chǎn)生特色風(fēng)味的菌種[3]。布魯塞爾酒香酵母經(jīng)常在果汁、紅酒、啤酒和西打酒中作為腐敗酵母出現(xiàn)，具有較高的產(chǎn)醋酸能力，能耐受較高的酒精度[15,29]。酒香酵母發(fā)酵制作葡萄酒過(guò)程中會(huì)散發(fā)蘋(píng)果香味，可能與異丁酸、己酸和異戊酸的產(chǎn)生有關(guān)[29]。Daenen等[30]篩選了一株β-葡萄糖苷酶活性較高的卡斯酒香酵母LD72，該菌株能水解酒花中的糖苷鍵化合物并釋放出揮發(fā)性芳香物質(zhì)，增加啤酒中特征風(fēng)味物質(zhì)，如芳樟醇、水楊酸甲酯、葉醇、1-辛烯-3-醇。多數(shù)酒香酵母可以產(chǎn)生異丁酸、己酸和異戊酸、4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚等，其中4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚等揮發(fā)酚在較低濃度時(shí)可以提供復(fù)雜的酒香味，在較高濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生令人不愉悅的氣味和味道[15]。因此，在應(yīng)用過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制酒香酵母及其代謝產(chǎn)物的含量。

1.1.4 酵母屬

酵母屬中的典型菌種是釀酒酵母，它是傳統(tǒng)酒類(lèi)飲品中最常用的菌種[3]，也多出現(xiàn)在紅茶菌中。祝霞等[31]研究發(fā)現(xiàn)引入釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵貴人香葡萄汁，其酒樣中酯類(lèi)物質(zhì)含量及種類(lèi)明顯高于其他組，主要為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯、9-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯和丁酸乙酯，這些酯類(lèi)物質(zhì)能夠賦予低醇葡萄酒濃郁的果香[32]；醇種類(lèi)相對(duì)較多，包括賦予酒樣薔薇香的壬醇和檸檬味、桃子味及玫瑰味的香葉醇。混菌發(fā)酵后的酒樣萜烯類(lèi)化合物的含量較高，其中大馬士酮可以賦予酒體強(qiáng)烈的花香、果香、紫丁香味。李理等[33]以克魯維酵母為對(duì)照，采用釀酒酵母發(fā)酵菠蘿果汁牛奶，能產(chǎn)生較多的氣體和較濃郁的酒香味。

張春花等[34]用釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵的普洱茶中萜烯醇類(lèi)化合物及其衍生物與甲氧基苯及其衍生物含量均較高，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了普洱茶陳醇的風(fēng)味特征。徐亞軍等[35]用釀酒酵母發(fā)酵云南大葉種綠茶和玉米，得到兼有茶香和醇香的綠茶酒。

1.1.5 其他酵母

除上述菌種外，部分研究分離出了其他酵母，包括粟酒裂殖酵母和耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）。粟酒裂殖酵母具有較高的乙醇和蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化能力[36]，用于朗姆酒和棕櫚酒生產(chǎn)，能降低酒類(lèi)粗糙感和酸澀感，增加酒的穩(wěn)定性，提升其風(fēng)味復(fù)雜性和口感[37-38]。陳良強(qiáng)等[39]分離的粟酒裂殖酵母產(chǎn)生的異丁醇和異戊醇含量顯著高于醬香型白酒常用釀酒酵母。張亞強(qiáng)等[36]研究表明，將粟酒裂殖酵母與釀酒酵母進(jìn)行順序發(fā)酵，能夠有效降解蘋(píng)果酸，消除釀造中因降酸而產(chǎn)生的不良?xì)馕?，提升野櫻莓果酒的品質(zhì)。

耐熱克魯維酵母是一種產(chǎn)乙醇能力中等、能產(chǎn)乳酸的非釀酒酵母，不能單獨(dú)完成乙醇發(fā)酵[40-41]。Benito等[42]利用耐熱克魯維酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)耐熱克魯維酵母在提高葡萄酒乳酸及甘油含量、增加揮發(fā)性香氣物質(zhì)方面有顯著效果。

王玉華等[43]采用耐熱克魯維酵母和粟酒裂殖酵母順序接種發(fā)酵降低了酒樣中酯類(lèi)、高級(jí)醇類(lèi)和酸類(lèi)化合物的含量，促進(jìn)了苯乙醇、萜烯類(lèi)和大馬士酮等揮發(fā)性化合物的生成，提高了香氣的復(fù)雜性，花果香氣明顯，改善了葡萄酒的色澤。

用于發(fā)酵食品的酵母種類(lèi)繁多，形成的風(fēng)味物質(zhì)各不相同，部分酵母能產(chǎn)生獨(dú)特的揮發(fā)性成分。在紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中，酵母的代謝產(chǎn)物能為醋酸菌進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)生風(fēng)味化合物提供前體物質(zhì)。因此在利用酵母時(shí)，可選育優(yōu)良菌種，并控制其用量或搭配其他菌種，優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而產(chǎn)生更多目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)。

1.2 紅茶菌中細(xì)菌種類(lèi)及其對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味的影響

紅茶菌中主要的細(xì)菌是醋酸菌[1,7-8]，此外，乳酸菌等其他細(xì)菌也在不同紅茶菌樣品中被鑒定出來(lái)（表2）。

表2 紅茶菌中分離的細(xì)菌Table 2 Bacterial species separated from Kombucha tea

1.2.1 醋酸菌

醋酸菌能氧化糖類(lèi)、糖醇和醇類(lèi)物質(zhì)并產(chǎn)生相應(yīng)糖醇、酮和有機(jī)酸，具有較強(qiáng)的產(chǎn)醋酸及其他揮發(fā)酸的能力且耐酸能力強(qiáng)，可生產(chǎn)胞外聚合物，比如葡糖醋桿菌和駒形桿菌能合成細(xì)菌纖維素[48-50]。紅茶菌中駒形桿菌（原屬于葡糖醋桿菌）與葡糖醋桿菌較為常見(jiàn)，醋酸桿菌種類(lèi)相對(duì)較少[51-52]。

1.2.1.1 駒形桿菌屬

駒形桿菌主要分離自發(fā)酵食品，如醋、紅茶菌、椰果和果汁[49]。因其最高產(chǎn)酸量高于醋酸桿菌，在工業(yè)上常用于生產(chǎn)醋酸[53]。駒形桿菌大多能夠產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，如木駒形桿菌、萊蒂亞駒形桿菌和中間駒形桿菌等[52]。Zhu Yunping等[54]發(fā)現(xiàn)在山西陳醋的醋酸發(fā)酵過(guò)程中駒形桿菌的生物量與乙酸-2-苯乙酯、糠醛、苯甲醛、3-羥基-2-丁酮和3-乙酸-2-丁酮的含量呈正相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)麥德林駒形桿菌能促進(jìn)紅醋中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)——脯氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸的形成[55]。

1.2.1.2 葡糖醋桿菌屬

葡糖醋桿菌能促進(jìn)包括酸、醇和酯類(lèi)在內(nèi)的芳香物質(zhì)的形成，通過(guò)小比例添加可用于生產(chǎn)傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵食品[56-57]。在固態(tài)發(fā)酵鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵過(guò)程中，葡糖醋桿菌是產(chǎn)有機(jī)酸的重要菌種，與揮發(fā)醇、川芎嗪和氨基酸的變化相關(guān)[58]。由于該研究中所述的歐洲葡糖醋桿菌已被重新分類(lèi)至駒形桿菌屬，因此相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)可能也與駒形桿菌屬有關(guān)。此外，葡糖醋桿菌也是烏衣紅曲糯米酒產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味的核心功能微生物[59]。

1.2.1.3 醋酸桿菌屬

紅茶菌中存在多種醋酸桿菌，此屬典型菌種為醋化醋酸桿菌，廣泛用于食醋的生產(chǎn)[52]。醋酸桿菌與醋酸發(fā)酵中的有機(jī)酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要。在鎮(zhèn)江香醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，醋酸桿菌與56 種風(fēng)味的產(chǎn)生相關(guān)，和乙酸-2-苯乙酯、糠醛、苯甲醛、3-羥基-2-丁酮和3-乙酸-2-丁酮含量呈正相關(guān)，也與揮發(fā)性酯類(lèi)、雜環(huán)芳香物、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸含量的變化有關(guān)[58-59]。

1.2.1.4 葡糖桿菌屬

葡糖桿菌常分離于葡萄酒和食醋中，可可豆的發(fā)酵過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)過(guò)此屬，其典型菌種氧化葡糖桿菌是最早被發(fā)現(xiàn)的醋酸菌之一，可以產(chǎn)生2,5-二酮葡萄糖酸、2-酮-L-葡萄糖酸鹽、抗壞血酸、D-葡萄糖酸、山梨酮糖和半乳糖酸等，其中葡萄糖酸能為食品提供香氣，是食醋生產(chǎn)中的感官質(zhì)量指標(biāo)[52,60-61]。

1.2.1.5 乳酸菌

紅茶菌中分離出的乳酸菌包括酒球菌、乳桿菌、明串珠菌、乳球菌等。Coton等[7]認(rèn)為在綠茶紅茶菌發(fā)酵中，乳酸菌，尤其是酒酒球菌為優(yōu)勢(shì)菌，而紅茶發(fā)酵紅茶菌時(shí)醋酸菌更有優(yōu)勢(shì)。酒酒球菌是適應(yīng)性最強(qiáng)的葡萄酒伴生菌，主要用于誘導(dǎo)紅葡萄酒、白葡萄酒和起泡葡萄酒中蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，對(duì)形成葡萄酒風(fēng)味有重要作用[47]。在鎮(zhèn)江香醋中，乳酸菌與53 種風(fēng)味有關(guān)，是產(chǎn)生有機(jī)酸的重要菌屬，與揮發(fā)性芳香物質(zhì)、揮發(fā)醇和氨基酸尤其是丙氨酸含量的變化相關(guān)。在烏衣紅曲酒中乳酸桿菌與乳球菌能促進(jìn)揮發(fā)性酸、醇、酯的產(chǎn)生[57]。

1.3 紅茶菌中微生物種類(lèi)在不同地區(qū)的差異

目前印度、中國(guó)、法國(guó)、愛(ài)爾蘭等國(guó)在紅茶菌微生物方面的研究較為深入，不同國(guó)家所鑒定出的菌種存在著一定差異，但存在某些菌屬重合度較高或某種菌豐度較高的情況。如Coton等[7]在法國(guó)西部沿海地區(qū)所分離鑒定的紅茶菌駒形桿菌菌種與徐偉等[16]在中國(guó)黑龍江省所鑒定的相似度較高，沙特阿拉伯和土耳其的樣品假絲酵母的種類(lèi)相對(duì)較多[1]。

比較中國(guó)和其他國(guó)家鑒定的菌種可以發(fā)現(xiàn)，中國(guó)紅茶菌研究中的14 個(gè)菌種在國(guó)外研究中鮮被提及，其中真菌為庫(kù)德畢赤酵母、歐格氏霉和阿氏酵母。有研究發(fā)現(xiàn)庫(kù)德畢赤酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵時(shí)能提高萜烯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、異戊醇、辛酸、己酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸辛酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等的含量，從而顯著增強(qiáng)葡萄酒的品種香氣和發(fā)酵香味[62]。在細(xì)菌方面，國(guó)內(nèi)樣品分離鑒定出了較國(guó)外更豐富的駒形桿菌（麥德林駒形桿菌、柿醋駒形桿菌）、醋酸桿菌（蘋(píng)果醋桿菌、固氮醋酸桿菌、塞內(nèi)加爾醋酸桿菌、醋化醋酸桿菌、巴氏醋酸桿菌）和葡糖桿菌（日本葡糖桿菌、弗氏葡糖桿菌），還發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵乳桿菌和纖維堆囊菌。醋酸桿菌和葡糖桿菌對(duì)于發(fā)酵食品的揮發(fā)性風(fēng)味都有著重要的影響。

現(xiàn)有研究雖采樣地廣泛，但來(lái)源不清，包括自行保存、地區(qū)家庭采樣、市售購(gòu)買(mǎi)等，部分菌種來(lái)源難以追溯，各研究所用的發(fā)酵工藝也不相同。開(kāi)發(fā)特色紅茶菌產(chǎn)品可更深入地研究地域性菌種并對(duì)特殊風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，研究我國(guó)紅茶菌中特有菌種對(duì)紅茶菌風(fēng)味的影響可為開(kāi)發(fā)我國(guó)特色紅茶菌產(chǎn)品提供新思路。

1.4 紅茶菌中微生物種類(lèi)在不同茶葉種類(lèi)中的差異

目前有關(guān)紅茶菌的研究大多以紅茶為發(fā)酵基底，少數(shù)使用綠茶，極少數(shù)研究利用普洱茶、路易波士茶等進(jìn)行發(fā)酵。紅茶、綠茶和普洱茶是我國(guó)常見(jiàn)品類(lèi)，根據(jù)對(duì)紅茶菌國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的總結(jié)，及紅茶菌優(yōu)勢(shì)菌群分析（圖2），發(fā)現(xiàn)這3 種茶的紅茶菌樣品中均發(fā)現(xiàn)過(guò)釀酒酵母和歐洲駒形桿菌。紅茶與綠茶發(fā)酵的紅茶菌中分離的15 個(gè)菌種相同，分別為拜氏接合酵母、佛羅倫薩接合酵母、博伊丁假絲酵母、布魯塞爾酒香酵母、萊迪亞駒形桿菌、中間駒形桿菌、木駒形桿菌、漢森駒形桿菌、過(guò)氧化醋酸桿菌、蒲桃醋酸桿菌、沖繩醋酸桿菌、熱帶醋酸桿菌、氧化葡糖桿菌、內(nèi)氏乳桿菌和酒酒球菌。紅茶與普洱茶紅茶菌中都分離出過(guò)食糖駒形桿菌。因針對(duì)以綠茶和普洱茶發(fā)酵的紅茶菌研究相對(duì)較少，圖2中所體現(xiàn)的紅茶特異性菌種較多可能是其他兩種茶的樣品量少所致[1-5,7,9,11-18,44-47]。茶葉本身的發(fā)酵程度如何影響紅茶菌的優(yōu)勢(shì)菌群仍有待進(jìn)一步探究。

圖2 不同茶底發(fā)酵紅茶菌的優(yōu)勢(shì)菌種差異[1-5,7,9,11-18,44-47]Fig. 2 Comparison of dominant microbes from Kombucha tea made with three types of tea[1-5,7,9,11-18,44-47]

2 紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化

紅茶菌的風(fēng)味物質(zhì)來(lái)自于茶底物及其衍生物、加入的糖底物以及糖茶水在發(fā)酵過(guò)程中形成的代謝產(chǎn)物，受共生微生物驅(qū)動(dòng)，可能會(huì)發(fā)生許多生物化學(xué)反應(yīng)，主要包括醇、醛的形成，以及醇、醛向酸、酯的轉(zhuǎn)化，其成分和含量隨發(fā)酵過(guò)程改變。微生物所產(chǎn)生的次生代謝物是紅茶菌中的主要風(fēng)味成分[4]。

目前分析紅茶菌特異性風(fēng)味物質(zhì)的研究很少，其關(guān)鍵性風(fēng)味成分尚未明確。風(fēng)味物質(zhì)的成因與微生物構(gòu)成的對(duì)應(yīng)關(guān)系研究屈指可數(shù)，如袁磊等[63]的研究雖檢測(cè)了紅茶菌的風(fēng)味物質(zhì)，但未鑒定其所用的紅茶菌菌種。已有的紅茶菌風(fēng)味物質(zhì)研究中所用的發(fā)酵茶底、發(fā)酵時(shí)間等均存在差異，很少分析茶中原有物質(zhì)差異所造成的風(fēng)味影響。

Zhao Zhenjun[4]和袁磊[63]等分別用普洱茶和紅茶制備紅茶菌，所檢出的共有風(fēng)味物質(zhì)有3 種，為乙酸、苯乙醇和芳樟醇；乙酸和芳樟醇在發(fā)酵前后含量變化趨勢(shì)一致，但苯乙醇含量變化呈現(xiàn)出相反趨勢(shì)。為找到紅茶菌中存在的風(fēng)味物質(zhì)與可能存在的功能微生物關(guān)系，圖3總結(jié)了在紅茶菌中檢出的部分風(fēng)味物質(zhì)和在發(fā)酵食品研究中與這些風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)且存在于紅茶菌中的微生物種類(lèi)。

從圖3可發(fā)現(xiàn)，能促進(jìn)產(chǎn)生花香、植物清香和果香的風(fēng)味物質(zhì)多為酵母，紅茶菌中多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)與釀酒酵母相關(guān)。發(fā)酵紅茶菌時(shí)可考慮適當(dāng)添加非釀酒酵母以增加其風(fēng)味，但需避免一些可產(chǎn)生如丙酸等有不愉快氣味的微生物。以丙酸為例，也可通過(guò)調(diào)整微生物組成或優(yōu)化發(fā)酵工藝使丙酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為具有較好風(fēng)味的下游產(chǎn)物，如丙酸酯等。因釀酒酵母在發(fā)酵工業(yè)廣泛使用，其研究相比其他非釀酒酵母更為深入，而有關(guān)非釀酒酵母的研究主要集中在葡萄酒釀造，且多與釀酒酵母共同使用[65]。然而非釀酒酵母廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，對(duì)于其風(fēng)味的形成及影響不容忽視，尤其紅茶菌中非釀酒酵母種類(lèi)繁多，其對(duì)于紅茶菌的特異性風(fēng)味的影響需進(jìn)一步深入研究。

圖3 紅茶菌中存在的微生物與相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)[2-5,7,9,12,14-16,19-20,24,27-31,34,39,43,54,59-60,63-64]Fig. 3 Flavor compounds and relevant microorganisms in Kombucha tea[2-5,7,9,12,14-16,19-20,24,27-31,34,39,43,54,59-60,63-64]

針對(duì)紅茶菌中風(fēng)味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的研究較少，所用于發(fā)酵的茶底分為普洱茶、紅茶和綠茶等，檢測(cè)的物質(zhì)種類(lèi)也存在一定差異。紅茶菌發(fā)酵的生普洱茶在發(fā)酵14 d后揮發(fā)性芳香物質(zhì)由21 種增至53 種。初期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源于茶本身，發(fā)酵3 d時(shí)主要的風(fēng)味物質(zhì)是醇類(lèi)和酸類(lèi)，含量高的5 種風(fēng)味物質(zhì)是庚醛、苯乙醛、苯乙酸、甲基辛酮、芳樟醇。發(fā)酵中期醇類(lèi)含量逐漸下降，酸類(lèi)物質(zhì)增多；到發(fā)酵中后期，醇類(lèi)和醛類(lèi)含量顯著降低，酸類(lèi)物質(zhì)繼續(xù)增多到22 種，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的57.21%，最多的5 種是乙酸、丁酸、苯乙酸、檸檬酸和2-甲基琥珀酸；發(fā)酵后期茶湯中主要包含醋酸、檸檬酸、丁酸、琥珀酸和L-乳酸[4]（圖4A）。袁磊等[63]利用紅茶菌發(fā)酵紅茶，其發(fā)酵前后與普洱茶紅茶菌相同，呈現(xiàn)出醛和酮相對(duì)含量減少、酸和酯相對(duì)含量增多的趨勢(shì)，而紅茶發(fā)酵后醇類(lèi)相對(duì)含量總體升高（圖4B），與普洱茶紅茶菌相反。這可能是由于紅茶發(fā)酵過(guò)程中醇類(lèi)的減少量少于生成量，因此發(fā)酵后檢測(cè)的醇相對(duì)含量仍高于發(fā)酵前。生普洱茶發(fā)酵的7～10 d風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)最為豐富，紅茶發(fā)酵后共新增了12 種風(fēng)味物質(zhì)，由此可見(jiàn)選擇終止發(fā)酵的時(shí)間對(duì)控制最終紅茶菌的風(fēng)味十分重要。

圖4 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定的紅茶菌風(fēng)味物質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig. 4 Changes in flavor compounds contents (measured by gas chromatography-mass spectrometry) during fermentation of Pu’er and black tea with Kombucha tea

2.1 醇類(lèi)

對(duì)生普洱茶紅茶菌發(fā)酵過(guò)程分析表明，醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)不同，其相對(duì)變化趨勢(shì)各異。初始相對(duì)含量較高的醇，如芳樟醇和苯乙醇相對(duì)含量在發(fā)酵前3 d呈現(xiàn)快速降低趨勢(shì)，隨后緩慢降低；而2,6-二甲基-4-乙基-4-庚醇和2,7-二甲基-4-辛烯-2,7-二醇等初始相對(duì)含量較低的醇，其相對(duì)含量則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。在14 d的發(fā)酵過(guò)程中，共檢測(cè)到16 種醇類(lèi)，其中新生了7 種高級(jí)醇，到發(fā)酵14 d時(shí)，基本上所有醇類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量都處于較低水平。醇類(lèi)總量降低可能因微生物轉(zhuǎn)化或發(fā)生酯化等生化反應(yīng)[4]。紅茶發(fā)酵后，正己醇、芳樟醇、(E)-2-己烯-1-醇相對(duì)含量降低，而乙醇、異戊醇、正辛醇、苯乙醇、橙花叔醇的相對(duì)含量升高，乙醇相對(duì)含量的增幅最大；且發(fā)酵后新產(chǎn)生了5 種醇，測(cè)得的醇類(lèi)總物質(zhì)種類(lèi)由3 種增至8 種，高級(jí)醇種類(lèi)的增加對(duì)紅茶菌風(fēng)味有積極影響[63]。

2.2 酸類(lèi)

蔣立文等[66]發(fā)現(xiàn)綠茶紅茶菌中總酸含量先升高后降低，與Zhao Zhenjun等[4,67]在普洱茶制備紅茶菌的研究中測(cè)得的變化一致，在生普洱紅茶菌中測(cè)出22 種有機(jī)酸，其中醋酸在14 d的發(fā)酵過(guò)程中，其相對(duì)含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸。袁磊等[63]發(fā)現(xiàn)醋酸、正己酸、正辛酸和正癸酸在發(fā)酵10 d后相對(duì)含量均有一定增加，其中正辛酸和正癸酸的增幅較大。

Jayabalan等[68]比較了以綠茶、紅茶和廢茶渣為茶底的紅茶菌發(fā)酵18 d過(guò)程中醋酸、D-葡萄糖醛酸、乳酸和檸檬酸含量的動(dòng)態(tài)變化。醋酸含量在第15天最高，隨后有所降低，綠茶發(fā)酵液中醋酸含量高于其他2 種茶底發(fā)酵液，乳酸和檸檬酸在3 種茶底中含量極低。

2.3 其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

醛類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)在紅茶菌發(fā)酵初期含量和種類(lèi)較多，中后期逐漸減少，酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)增多。Zhao Zhenjun等[4]研究發(fā)現(xiàn)，生普洱茶發(fā)酵14 d后，醛類(lèi)由6 種減至1 種，酮類(lèi)由3 種減至2 種，且相對(duì)含量均降低。酯類(lèi)除十八醇乙酸酯的相對(duì)含量降低外，新產(chǎn)生了5 種高級(jí)酯類(lèi)。同樣，袁磊等[63]發(fā)現(xiàn)紅茶發(fā)酵10 d后，3 種醛類(lèi)和1 種酮類(lèi)均未檢出，新產(chǎn)生5 種酯類(lèi)，其中乙酸乙酯相對(duì)含量最高，而初期含有的辛酸甲酯和水楊酸甲酯相對(duì)含量降低；此外，紅茶菌發(fā)酵過(guò)程還產(chǎn)生了芳烴、烯類(lèi)等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[4,63]。

紅茶菌中還含有影響感官品質(zhì)的酚類(lèi)物質(zhì)和游離氨基酸。酚類(lèi)物質(zhì)是產(chǎn)生斂口澀味和苦味的主要因素?？偠喾雍侩S發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加，可能因?yàn)榧t茶菌微生物中的復(fù)雜酶將多酚降解成了更小的分子[69]。在發(fā)酵過(guò)程中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，總兒茶素和咖啡因在發(fā)酵液中逐漸降解，酯型兒茶素含量逐漸減少，非酯型兒茶素含量略有增加[4,68]。蔣立文[66]和Zhao Zhenjun[4]等分別用紅茶菌發(fā)酵綠茶和普洱茶，咖啡因含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這可能是微生物利用咖啡因作為氮源導(dǎo)致的；紅茶菌中總游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)略有增加，這些游離氨基酸是最重要的芳香前體物質(zhì)，如：亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸分解后轉(zhuǎn)化為有麥芽香氣的酯類(lèi)物質(zhì)、有果香和酒精味的醇類(lèi)物質(zhì)或呈現(xiàn)酸甜味、腐敗味、水果味或黃油味的酸類(lèi)物質(zhì)。芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）分解后會(huì)產(chǎn)生玫瑰香、花香、苦杏仁味或腐臭等異味[70]。

酵母與細(xì)菌的共生菌落是紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)形成的最重要因素[4]，了解紅茶菌的微生物組成以及優(yōu)勢(shì)菌種在發(fā)酵食品中帶來(lái)的感官變化對(duì)紅茶菌風(fēng)味改良非常重要。通過(guò)確定微生物對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成及變化的影響，選擇能夠促進(jìn)高級(jí)醇類(lèi)、萜烯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)生成的微生物，如釀酒酵母、假絲酵母等，從而增加茶湯中的果香花香等愉悅氣味，避免產(chǎn)生腐臭味等物質(zhì)的微生物，或通過(guò)不同微生物組合，使其產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)能通過(guò)生化反應(yīng)進(jìn)一步提升茶湯風(fēng)味。了解風(fēng)味物質(zhì)在紅茶菌發(fā)酵過(guò)程的變化，有助于確定合適的發(fā)酵時(shí)間，避免發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致味道寡淡，或單種物質(zhì)含量過(guò)高。選擇發(fā)酵中期最適終點(diǎn)，能夠保留一部分醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)并生成適量的酸類(lèi)、萜烯類(lèi)等，使茶湯風(fēng)味更加豐富。

3 結(jié) 語(yǔ)

紅茶菌作為一種近幾年才開(kāi)始工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵飲料，主要的研究集中在其功效評(píng)價(jià)、化學(xué)成分、菌種組成等方面。但各研究的菌種來(lái)源復(fù)雜，用于發(fā)酵紅茶菌的茶葉種類(lèi)多樣，導(dǎo)致現(xiàn)有研究中紅茶菌微生物組成及化學(xué)成分差異較大，難以形成衡量紅茶菌品質(zhì)的統(tǒng)一指標(biāo)，其風(fēng)味穩(wěn)定性和食品安全性難以保障。

本文通過(guò)總結(jié)不同研究中分離自紅茶菌的菌種及其在發(fā)酵食品中相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)，推測(cè)不同微生物可能對(duì)紅茶菌風(fēng)味的影響。對(duì)不同紅茶菌樣品中微生物種類(lèi)與其發(fā)酵底物和采樣地的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行初步分析，推測(cè)不同茶葉及其發(fā)酵程度能顯著影響紅茶菌微生物組成，且通過(guò)挖掘我國(guó)紅茶菌中特有菌種，可開(kāi)發(fā)具有我國(guó)特色的紅茶菌產(chǎn)品。本文總結(jié)發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母可產(chǎn)生多種紅茶菌中的風(fēng)味物質(zhì)。醋酸菌除影響酸度外，對(duì)其他揮發(fā)性芳香物質(zhì)的產(chǎn)生也有促進(jìn)作用。在紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中，復(fù)配使用多種非釀酒酵母可提高其風(fēng)味的豐富程度。目前針對(duì)紅茶菌中各菌種影響風(fēng)味物質(zhì)變化的研究還很欠缺，現(xiàn)有研究對(duì)紅茶菌特色風(fēng)味物質(zhì)尚未有結(jié)論，各研究選取檢測(cè)的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)存在較大差異。微生物組成對(duì)紅茶菌風(fēng)味的影響及機(jī)理仍有極大的研究空間。

本文對(duì)比了不同茶的紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)總體變化趨勢(shì)相近，醇類(lèi)變化存在一定差異，或與茶底種類(lèi)和發(fā)酵時(shí)間有關(guān)。紅茶菌作為發(fā)酵茶飲料，需控制終產(chǎn)品的乙醇含量。根據(jù)本文總結(jié)的風(fēng)味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化情況，可考慮在發(fā)酵中期乙醇含量降至限定值后停止發(fā)酵，從而保留一定的醇、醛和酮類(lèi)，與產(chǎn)生的酯類(lèi)、酸類(lèi)共同形成紅茶菌豐富的香味。相同紅茶菌菌種發(fā)酵不同茶葉時(shí)風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化差異及其原因仍缺少系統(tǒng)性的研究分析，部分物質(zhì)變化分析中未鑒定所用菌種。因不同茶葉所含初始風(fēng)味物質(zhì)及不同菌種代謝途徑的區(qū)別，系統(tǒng)研究微生物與紅茶菌中風(fēng)味物質(zhì)變化關(guān)系對(duì)調(diào)整優(yōu)化紅茶菌飲料配方非常重要。