王麗萍，王春燕，晏 紅，賈旭強(qiáng)，張 欽

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院病理科，甘肅 蘭州 730030 3.定西市人民醫(yī)院風(fēng)濕內(nèi)分泌科，甘肅 定西 743000；4.山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院脊柱外科，山西 運(yùn)城 044000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種主要累及育齡女性，以多系統(tǒng)、多臟器損害為特征的全身性自身免疫病。流行病學(xué)研究表明，我國的 SLE 患病率為 0.03%～0.7%，據(jù)此估算，我國的SLE患者有近100萬。由于自身抗體沉積靶器官及繼發(fā)性血管炎導(dǎo)致器官功能障礙，SLE可以造成患者殘疾甚至死亡，其中，由SLE疾病活動造成的腎臟損傷是SLE的重要臟器受損之一，影響預(yù)后，是風(fēng)濕病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對其發(fā)病機(jī)制的大量研究發(fā)現(xiàn)SLE患者存在多種免疫細(xì)胞 (B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞系等)的功能紊亂，導(dǎo)致多克隆B細(xì)胞活化、高球蛋白血癥、自身抗體產(chǎn)生及免疫復(fù)合物的形成，究其根本原因?yàn)闄C(jī)體免疫耐受的喪失和免疫細(xì)胞的異常激活并對自身組織結(jié)構(gòu)發(fā)生自身免疫反應(yīng)。在免疫功能紊亂調(diào)節(jié)過程中諸多細(xì)胞因子及信號通路參與其中[1]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路具有重要的生理學(xué)活性,可能是腎臟纖維化進(jìn)程中的調(diào)控因子，與原發(fā)性腎臟疾病的腎小球硬化進(jìn)展中細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積有關(guān)，而狼瘡腎炎患者發(fā)病中此信號通路所扮演的角色還鮮有研究。本課題將以狼瘡腎炎 （Lupus nephritis,LN）為研究對象以期發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路在狼瘡腎炎發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究為前瞻性研究。篩選來自2016年8月～2018年8月定西市人民醫(yī)院風(fēng)濕內(nèi)分泌科、腎內(nèi)科和蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、腎內(nèi)科住院的年齡18～50歲的60例狼瘡腎炎、60例原發(fā)性腎小球腎炎患者，分別符合美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）1997年SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[2]和腎活檢確診為原發(fā)性腎小球腎炎、狼瘡腎炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集120例患者的血清、尿液、腎組織標(biāo)本。所有腎活檢患者均為術(shù)前當(dāng)天晨起留取清潔中段尿5mL，離心分離2mL，取上清液后置于20℃冰箱中保存，標(biāo)本于3個月內(nèi)檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：年齡 18～50 歲，平均年齡 39.7±7.5 歲；所有患者均自愿參與試驗(yàn)并簽署知情同意書。經(jīng)篩選符合試驗(yàn)條件的受試者分別進(jìn)入觀察組、對照組，觀察組）狼瘡腎炎患者男 11 例(18.3%)，女 49 例(81.7%)，對照組—原發(fā)性腎小球腎炎患者男性14例（23.3%），女46 例（76.7%）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

為了確定TGF-β和Smad7的作用，用Smad7模擬物、Smad7抑制劑轉(zhuǎn)染之前或轉(zhuǎn)染之后的Smad7培養(yǎng)腎組織細(xì)胞。用 RPMI-1640（Life Technologies，CA，USA） 做細(xì)胞培養(yǎng)液，Smad7 要取相同量的血漿中所分離的，腎組織細(xì)胞來自于腎活檢患者提取的。

2.2 血清、尿液RNA分離

使用 TRIzol試劑（Takara，Dalian，China）分離來自外膜的總RNA

①培養(yǎng)細(xì)胞：外周血細(xì)胞 1-5×107，移入 1.5mL離心管中，加入1mL Trizol，混勻，室溫靜置5min；

②加入 0.2mL 氯仿，振蕩 15s，靜置 2min；

③4℃離心，12000g×15min，取上清；

④加入0.5mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；

⑤4℃離心，12000g×10min，棄上清；

⑥加入1mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清；

⑦晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10～15min）。

2.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄為miRNA cDNA和總cDNA

使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（Takara，大連，中國）和 PrimeScript RT試劑盒（Takara，大連，中國）。

2.4 定量RT-PCR分析 （qPCR）各組腎組織TGF-βmRNA、Smad7mRNA 表達(dá)水平

使用Applied Biosystems 7500快速實(shí)時PCR系統(tǒng)實(shí) 時 PCR 系 統(tǒng) （Applied Biosystems，Carlsbad，USA）和 SYBR Premix Ex Taq（Takara，Dalian，China）根據(jù)制造商的說明通過qPCR檢測mRNA和miRNA表達(dá)水平。并分別對GAPDH mRNA和小核RNA U6進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用2-ΔΔCt方法定量TGF-β和Smad7的Ct值。GAPDH內(nèi)參照引物用DNA Club軟件設(shè)計，TGF-β及Smad7引物分別參照文獻(xiàn)[3]由上海生工生物工程公司合成序列如下。TGF-β上游引物為 5′CTTTAGGAAGGACCTGGGTT 3′，下游引物 5′CAGGAGCGCACAATCATGTT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物258 bp；Smad7 上游引物為 5′TCCTGCTGTGCAAA GTGTTC3′,下游引物為 5'AGTAAGGAGGAGGGGGA GAC3′, 產(chǎn)物為 164bp；GAPDH 上游 引物為 5′CTGGGC CGCTCTAGCCACCAA3′, 下游引物為 5′CTCTITGTATCACG CACGArITTC3′, 產(chǎn) 物 452bp。TGFβPCR 反應(yīng)體系：5×PCR 緩沖液 5μL、MgCl2(25 mmol.L-1)O.5μl、dNTPs(10mmol.L-1)0.25μL、上游及 下 游 引 物 （25μmol.L-1） 各 0.5μl,cDNA 模 板3.5μl、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，補(bǔ)足雙蒸水至 25μL；Smad7 PCR 反應(yīng)體系：5×PCR 緩沖液5μl、MgCI2(25mmol.L-1)0.5μl、dNTPs(10 mmol.L-1)0.25μL、 上游及下游引物 （25μmol.L-1） 各 1μL、cDNA 模板 2.5μL、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，補(bǔ)足雙蒸水至25μL。PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，TGFβ條件為：94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 30s,50℃退火 30s,72℃延伸1 min,共循環(huán)30次，72℃終末延伸7min；Smad7改退火溫度為52℃,其余與TGFβ相同。

2.5 免疫組織化學(xué)方法

SP法,采用一步法免疫組織化學(xué)法檢測兩組患者腎組織中TGF-β、Smad7的表達(dá),簡要檢測步驟為:①腎組織標(biāo)本行冰凍切片，厚為5 μm,經(jīng)丙酮(4 C預(yù)冷)固定15-30min；②加入0.2%皂索室溫放置30～45 min；③2%HO,室溫作用 15 min 去除內(nèi)源性過氧化物酶；④加人試劑盒中特異性多聚酶標(biāo)記的鼠源單克隆一抗4工過夜。以上各步驟之間均使用含0.02%吐溫-20的磷酸鹽緩中液(PBS)洗海至少3次每次5 min；⑤加人二氨基聯(lián)苯胺(DAB)應(yīng)用液作用5～20 min,顯微鏡下終止顯色，蘇木素復(fù)染,封片,顯徽鏡下觀察結(jié)果。同時設(shè)立陰性對照:分別PBS代替一抗,其余步驟不變。

2.6 采用ELISA法

檢測血清和尿液中TGF-β、Smad水平，試劑由R&D公司提供,按1:100稀釋，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.7 腎活檢

腎組織病理形態(tài)在B超引導(dǎo)下作經(jīng)皮腎組織穿刺自動活檢術(shù)取出腎組織，所取腎組織長度為10～15mm，光鏡下觀察均有5個以上腎小球。腎組織標(biāo)本采用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，制成2μm厚的切片，常規(guī)HE和PAS染色，由病理學(xué)專家根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]作組織學(xué)診斷。

3 統(tǒng)計方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示，計數(shù)資料用構(gòu)成比表示，計量資料采用t檢驗(yàn)的形式(組間比較)。相關(guān)性分析用Cox回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

1）ELISA法檢測兩組患者血清中TGF-β的含量，觀察組較對照組含量高，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。（見表 1）

表1 兩組患者血清TGF-β的含量（±s）

表1 兩組患者血清TGF-β的含量（±s）

組別 OD 值 TGF-β（pg/mL）觀察組 0.416±0.019 500.3±98.7對照組 0.579±0.019 274.9±11.5

2）ELISA法檢測兩組患者尿液中TGF-β的含量，觀察組較對照組含量高，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。（見表 2）

表2 兩組患者尿液中TGF-β的含量（±s）

表2 兩組患者尿液中TGF-β的含量（±s）

組別 OD 值 TGF-β（ng/mgCr）觀察組 0.489±0.090 405.3±239.7對照組 0.937±0.158 77.1±40.8

3）RT-PCR半定量分析結(jié)果：TGF-β、Smad7 mRNA表達(dá)觀察組與對照組比較差異有顯著性 (P<0.05)，（見表 3）。

表3 各組腎組織TGF-β、Smad7mRNA表達(dá)的半定量分析（±s）

表3 各組腎組織TGF-β、Smad7mRNA表達(dá)的半定量分析（±s）

組別 TGF -βmRNA/GAPDHmRNA Smad7mRNA/GAPDHmRNA觀察組 1.55±0.78 0.83±0.04對照組 0.81±0.08 0.26±0.18

4）免疫組化半定量分析結(jié)果：患者腎組織TGF-β、Smad7蛋白主要表達(dá)在皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)（如圖1所示）。TGF-β、Smad7蛋白表達(dá)觀察組較對照組均明顯增強(qiáng)(P<0.05)（如圖2所示，見表4）。

圖1 腎組織TGF-β、Smad7蛋白主要表達(dá)在皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)

圖2 A對照組腎細(xì)胞TGF-β表達(dá)陰性對照,B觀察組腎細(xì)胞TGF-β陽性表達(dá),C對照組腎細(xì)胞Smad7表達(dá)陰性對照,D觀察組腎細(xì)胞Smad7陽性表達(dá)

表4 兩組腎組織，免疫組化的半定量分析（±s）

表4 兩組腎組織，免疫組化的半定量分析（±s）

組別 TGF-β Smad7觀察組 3.80±0.73 2.02±0.33對照組 0.32±0.14 0.48±0.05

5 討論

眾所周知，TGF-β是調(diào)節(jié)腎臟纖維化的一個主要細(xì)胞因子。TGF-β造成腎臟纖維化可能通過以下幾種機(jī)制[4]：(1)減少了細(xì)胞凋亡；(2)直接使成纖維細(xì)胞或者其他類型細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)增多、分解減少；(3)促進(jìn)其他類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，從而造成更多的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，損傷腎組織。TGF-β對纖維化起著決定性作用，其下游信號分子也發(fā)揮著協(xié)同或者是拮抗的作用。目前Smad3信號蛋白在維化中所扮演的角色最為清楚明了，越來越多的研究證實(shí)Smad3在組織的修復(fù)和纖維化的過程中發(fā)揮著重要的作用，比如：傷口的愈合，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞以及各種肝臟、心臟、腎臟、皮膚、肺疾病過程中的瘢痕形成。TGF-β與胞膜上的TGF-β受體相結(jié)合后刺激Smad-3蛋白的基序SSXS磷酸化，并與Smad-2、Smad-4蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，通過3種方式 (直接與DNA結(jié)合、與其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)合、與轉(zhuǎn)錄共激活子結(jié)合)調(diào)控轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡[5]，在腎臟則表現(xiàn)為各型膠原、纖維連接蛋白、a—sma表達(dá)增加[6]，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，分解增加，腎小管硬化，腎間質(zhì)纖維化[7]。綜上所述，現(xiàn)認(rèn)為LN患者血清可刺激HK-2細(xì)胞分泌TGF-β，作用于細(xì)胞表面TGF-β受體，再經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加了纖維化信號通路上信號蛋白Smad3的磷酸化，相關(guān)表型蛋白表達(dá)增加，ECM沉積，腎臟纖維化。

以往的研究均表明，Smad4對Smads信號通路依賴型靶基因的激活至關(guān)重要，它是目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯-Co-Smads。Smad7在其他腎臟疾病中的表達(dá)有學(xué)者作過研究，但結(jié)果不盡相同。Fukasawa等[8]在大鼠腎梗阻模型(UUO)研究中發(fā)現(xiàn)，隨著UUO大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，Smad 7mRNA表達(dá)水平不斷增高,而蛋白表達(dá)水平卻降低，進(jìn)一步研究顯示,可能由于Smad的泛素調(diào)節(jié)因l、2(Smad ubiquitin regulatory factorsSmurfs)，也稱 E3泛肽酶 (E3 ubiquitin ligases表)達(dá)水平增高,導(dǎo)致Smad7蛋白的降解和泛肽化活性顯著增強(qiáng)。Uchica等[9]在腎小球膜增生性腎炎大鼠模型 (anti-Thylnephriti中s)發(fā)現(xiàn) Smad7在腎小球表達(dá)降低，但Ostendorf等[10]卻在相同的模型中得到了相反的。

國內(nèi)王美美團(tuán)隊在狼瘡鼠模型[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性GVHD LN小鼠腎組織均檢測到Smad4及Smad7mRNA和蛋白的表達(dá)，LN小鼠腎組織Smad蛋白及mRNA的表達(dá)均顯著高于正常腎鼠模型組(P＜0.05)。對這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能解釋：(1)以往她們團(tuán)隊的研究[12]在LN腎組織中TGF-β的表達(dá)水平顯著增高,Smad4作為TGF-β下游信號傳導(dǎo)的承擔(dān)者，隨著腎臟纖維化病程不斷惡化和TGF-β表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)；另外，Smad7基因啟動子區(qū)包含1個Smad3-Smad 4復(fù)合物的結(jié)合序列(GTCTAGAC)，因此TGF-β和Smad4表達(dá)水平增強(qiáng)會顯著上調(diào)Smad7的表達(dá)；(2)近來研究發(fā)現(xiàn)，Smads信號通路的抑制物（如：SnoN和Ski等）在纖維化的腎臟中表達(dá)水平降低[13]，提示Smads抑制物表達(dá)的降低可能是腎臟纖維化中Smads表達(dá)增高的重要機(jī)制；(3)Smad7在LN腎組織中的表達(dá)增強(qiáng)，但內(nèi)源性Smad7的表達(dá)卻不足以抑制纖維形成反應(yīng)，因?yàn)門GF-β對內(nèi)源性Smad7表達(dá)的刺激不足以克服其活化R'Smads而產(chǎn)生的纖維化效應(yīng)，對此的可能解釋是Smad7表達(dá)的基本水平 （即使受到刺激時）能阻止R-Smads介導(dǎo)TGF-β效應(yīng)，這一監(jiān)控形成了一個內(nèi)源性Smad7表達(dá)的刺激閾值，超過這一閾值則發(fā)生纖維形成反應(yīng)[14]，而可能通過一個適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)（如：轉(zhuǎn)染Smad7基因）[15]使 Smad7異位表達(dá)，這可能是治療腎臟纖維化的一種手段。

本文通過細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA、PT-PCR、免疫組化的檢測均表明LV腎組織均有TGF-β、Smad7的表達(dá)，且表達(dá)高于原發(fā)性腎小球腎炎患者。這說明LN腎損害炎癥因子參與的過程中，有TGF-β/Smad7這一信號通路的作用參與。LN病人TGF-β/Smad7異常是腎損傷產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，并為LN免疫干預(yù)治療提供理論依據(jù)。