田雨晴，周煒，婁兆文

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

癌癥是威脅人類健康的最嚴(yán)重的疾病之一[1].由于療效及毒副作用等問題，抗癌化療藥物臨床應(yīng)用的實(shí)際效果并不顯著，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類的需求.開發(fā)較氟尿嘧啶(5-FU)[2]，順鉑(DDP)[3],紫杉醇(TAX)[4]和木豆素衍生物[5]等臨床用藥更有效、更安全、更廉價(jià)的新型抗腫瘤藥物，意義重大.

在長期研究季鏻鹽化合物的抗腫瘤活性[6]基礎(chǔ)上，本研究對前期報(bào)道[7]合成的兩個(gè)合成路線相對簡單、預(yù)計(jì)成本低廉、初篩藥效明顯的季鏻鹽化合物進(jìn)行了進(jìn)一步研究，以間三氟甲基苯胺為原料，氯代烷酰氯為連接基團(tuán)，通過優(yōu)化合成方法，以期提高目標(biāo)物產(chǎn)率，尤其是提高產(chǎn)物純度；以5-FU為陽性對照，通過CCK8法，測試氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻和氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻對人表皮癌細(xì)胞(A431)、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87-MG)、人肝永生化細(xì)胞(THLE-2)、人肝癌細(xì)胞(QGY-7701)、人肺退行性癌細(xì)胞(CALU-6)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW-480)、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(ISHIKAWA)、人胃癌細(xì)胞(NCI-N87)、人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)和人肝癌細(xì)胞(Hep G2)的毒性，以期進(jìn)一步評價(jià)化合物的抗腫瘤活性.

圖1 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻

圖2 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻

1 合成方法優(yōu)化

1.1 儀器與材料INOVA 600MHZ核磁共振儀(美國瓦里安生產(chǎn))，Spectrum one型紅外分光光度計(jì)(美國 PE公司)，LCMS-8040三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津).所有化學(xué)試劑均為市售化學(xué)純或分析純試劑.

圖3 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻合成路線

1.2 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的合成取0.646 g(4.01 mmol)間三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.405 g(4.00 mmol)三乙胺.冰水浴，攪拌，滴加經(jīng)20 mL氯仿稀釋的0.559 g(4.40 mmol)3-氯丙酰氯.反應(yīng)20 min后，依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，水相再用氯仿萃取.合并有機(jī)相，再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得中間體3-氯丙酰間三氟甲基苯胺粗產(chǎn)品.中間體無需純化，直接加入0.972 g(3.71 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯，加熱冷凝回流約48 h.減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱層析分離(先甲苯洗脫三苯基膦及易溶有機(jī)物，再以甲苯-乙醇[體積比9∶1]洗脫)，得到油狀物質(zhì)0.982 g，產(chǎn)率47.65%(文獻(xiàn)[7]中為43.48%),IR(KBr)cm-1:3 406.59,2 867.24,1 680.97,1 602.95,1 568.51,1 486.64,1 449.25,1 340.65,1 282.35，1 257.87,1 171.04,1 113.60,1 069.40,722.39,692.58，527.36(文獻(xiàn)[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.74(s，1H);8.21(s,1H);7.89(d,J=8.40 Hz,1H);7.89～7.81(m,15H);7.80(t，1H);7.36(d，J=4.07 Hz,1H);3.84(t,J=8.12 Hz,2H);3.24(t,J=8.44 Hz,2H)(文獻(xiàn)[7]).

圖4 氯化-N-間三氟甲基苯基-N-丁酰胺基三苯基鏻合成路線

1.3 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的合成取0.804 g(4.99 mmol)間三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.506 g(5.00 mmol)三乙胺，冰水浴攪拌，滴加經(jīng)20 mL氯仿稀釋的0.775 g(5.50 mmol)4-氯丁酰氯.反應(yīng)約20 min后，依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，水相再用氯仿萃取.合并有機(jī)相，再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得中間體4-氯丁酰間三氟甲基苯胺粗產(chǎn)品.中間體無需純化，直接加入1.230 g(4.69 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯.加熱冷凝回流約48 h.減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱層析分離(先甲苯洗脫三苯基膦及易溶有機(jī)物，再以甲苯-乙醇[體積比9∶1]洗脫)，得到白色固體1.12 g，產(chǎn)率42.43 %(文獻(xiàn)[7]中為11.44%).IR(KBr)cm-1:3 417.80,2 944.87,1 681.62,1 604.70,1 532.62,1 439.03,1 326.87,1 258.50,1 159.48,1 114.98,1 067.68,1 016.62,848.97,743.45,691.94,532.96(文獻(xiàn)[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.53(s,1H);8.30(s,1H);7.98(d,1H);7.82～7.67(m,15H);7.32(t,1H);7.24(d,1H);3.60(m,2H);3.05(t,2H);2.08(d,2H)(文獻(xiàn)[7]).

1.4 合成方法改進(jìn)及質(zhì)譜驗(yàn)證與文獻(xiàn)相比，為提高產(chǎn)品純度，本研究在減少酰氯比例基礎(chǔ)上，增加了溶劑稀釋活性反應(yīng)物氯代烷酰氯的步驟，以便控制反應(yīng)速率；取消了合成中間產(chǎn)物酰胺過程中加熱冷凝回流步驟，防止非?；鵆―Cl鍵的氯水解、胺解等副反應(yīng).根據(jù)產(chǎn)物特性，在純化最終產(chǎn)品時(shí)，采取了分段淋洗方案，即先用甲苯洗脫三苯基膦及其它易溶有機(jī)物雜質(zhì)，再用甲苯-乙醇(體積比為9∶1)分離目標(biāo)產(chǎn)物，提高了產(chǎn)率和產(chǎn)品純度.

兩個(gè)化合物的質(zhì)譜圖見圖5、圖6.

圖5 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的質(zhì)譜

圖6 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的質(zhì)譜

圖5、圖6表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻Mr為513.92，氯化N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻Mr為527.95，且(M―Cl)∶(M―Cl+2)≈3∶1，進(jìn)一步驗(yàn)證了所得化合物結(jié)構(gòu)與純度.

2 細(xì)胞毒性研究

2.1 實(shí)驗(yàn)材料肝臟THLE-2正常細(xì)胞株、肝癌HepG2、QGY-7701細(xì)胞株、肺癌Calu-6細(xì)胞株、胃癌NCI-N87細(xì)胞株、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株、結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株、宮頸癌Ishikawa細(xì)胞株、皮膚癌A431細(xì)胞株、膠質(zhì)瘤U-87 MG細(xì)胞株由武漢合研生物醫(yī)藥科技有限公司提供.

2.2 CCK8法檢測前1天，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，每孔接種80 μL細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育過夜.實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，每孔加入20 μL化合物工作液,37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h.結(jié)束孵育后，往細(xì)胞板中加入CCK8 10 μL/孔，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～2 h.在Nivo上測定450 nm波長處的吸光度，計(jì)算活率.

計(jì)算方法(測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度)：

細(xì)胞活率/%=ODs/AVER(ODNC)×100%，

其中：ODS：樣品孔的吸光值(待測化合物)；ODNC：陰性孔吸光值(細(xì)胞+培養(yǎng)基+DMSO).

2.3 檢測結(jié)果檢測結(jié)果見表1.

表1 兩個(gè)季鏻鹽與細(xì)胞作用的IC50

其中，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻簡稱“丙鹽”，氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻簡稱“丁鹽”.10種細(xì)胞分別為：人表皮癌細(xì)胞(A431)、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87-MG)、人肝永生化細(xì)胞(THLE-2)、人肝癌細(xì)胞(QGY-7701)、人肺退行性癌細(xì)胞(CALU-6)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW-480)、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(ISHIKAWA)、人胃癌細(xì)胞(NCI-N87)、人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、人肝癌細(xì)胞(Hep G2).

3 結(jié)果與討論

3.1 季鏻鹽抗癌作用分析表1結(jié)果表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻總體的IC50小于氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻，說明前者有更強(qiáng)的抗腫瘤活性.兩種季鏻鹽對THLE-2(人肝永生化細(xì)胞)、A431(人表皮癌細(xì)胞)和NCI-N87(人胃癌細(xì)胞)抑制活性較強(qiáng).與文獻(xiàn)[8]比較，3-(鄰三氟甲基苯胺基酰基)丙基三苯基膦對小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)的IC50=23.49 μmol·L-1，而氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基季鏻鹽對人表皮癌細(xì)胞(A431)、人胃癌細(xì)胞(NCI-N87)的IC50較前者低，說明此季鏻鹽三氟甲基位置的不同，對癌細(xì)胞的抑制作用不同，且間位的活性相對較弱.

3.2 問題分析在本研究中，共使用了9種癌細(xì)胞和1種正常細(xì)胞，其中人肝癌細(xì)胞(QGY-7701)、人肝癌細(xì)胞(Hep G2)和人肝永生化細(xì)胞(THLE-2)屬于人體相同器官，而人表皮癌細(xì)胞(A431)、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Μ87-MG)、人肺退行性癌細(xì)胞(CALΜ-6)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW-480)、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(ISHIKAWA)、人胃癌細(xì)胞(NCI-N87)、人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)并沒有使用相對應(yīng)同種部位的正常細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn).若兩種季鏻鹽對于以上癌細(xì)胞所在同種器官或組織的正常細(xì)胞的毒性較小，則可以認(rèn)為這兩種季鏻鹽對于某種癌癥的治療有較為出色的表現(xiàn)，這需要進(jìn)行更多的細(xì)胞測試，而本研究的數(shù)據(jù)不足以說明這一點(diǎn).

文獻(xiàn)[7]中檢測數(shù)據(jù)表明，對小鼠肉瘤細(xì)胞S180，5-氟尿嘧啶的抑制率為38.82%(50 μg/mL)，要比氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻97.54%(50 μg/mL)低很多；而本研究參照文獻(xiàn)[9]值，對HepG-2(人肝癌細(xì)胞)，5-氟尿嘧啶的IC50=(9.92±1.09)μmol·L-1，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻的IC50為36.20 μmol·L-1，弱了大約314，說明尚需進(jìn)行深入細(xì)致的研究.

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了兩個(gè)具抗腫瘤活性的季鏻化合物的合成條件，顯著提高了產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度，為該類化合物的進(jìn)一步應(yīng)用研究積累了有益的數(shù)據(jù).本研究表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性；在評價(jià)這類化合物的細(xì)胞毒性時(shí)，化合物結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)但其規(guī)律性尚未明確，且生物活性的研究方法不同結(jié)果也存在明顯差異；要判斷該類化合物的藥用價(jià)值與應(yīng)用前景，尚需進(jìn)一步深入研究.