何雅婷，居超明，陳建國

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430062)

0 引言

水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，是世界一半以上人口的主要食物來源[1].由于人口增長的壓力越來越大，再加上生物和非生物脅迫導(dǎo)致的作物減產(chǎn)，迫切需要采用可持續(xù)戰(zhàn)略來改善糧食供應(yīng)[2-4].持綠(stay-green)性狀的利用是克服當(dāng)前作物產(chǎn)量瓶頸的一種重要策略，同時還可以提高品種的適應(yīng)性和穩(wěn)定性[5].持綠性是指模式植物和作物物種中葉片衰老延遲的可遺傳的特征[6].在作物中，持綠性使植株能夠保持綠色并在非生物脅迫下繼續(xù)進(jìn)行光合作用[7].持綠性與葉肉細(xì)胞的抗氧化狀態(tài)和光系統(tǒng)II有關(guān)[8].在許多谷類作物中，持綠植株通常具有較高的葉綠素含量并且在籽粒灌漿期間對非生物脅迫更具耐受性.在高粱中觀察到，在水分脅迫條件下的籽粒灌漿期間，具有這種性狀的基因型比缺乏它的基因型保持更多的光合活性葉面積[9].由于水分脅迫，同化作用受限，持綠性在小麥籽粒灌漿期也起著重要作用[10].因此，研究水稻持綠性對作物改良具有重大意義.

whirly 1最初發(fā)現(xiàn)是參與水楊酸依賴性病原體應(yīng)答(pathogen response，PR)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子[11]，但后來的研究也在葉綠體中檢測到whirly 1 蛋白[12].通過構(gòu)建在葉綠體內(nèi)能合成帶有重組血凝素(HA)標(biāo)簽的whirly 1蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草證明了whirly 1能從葉綠體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[13].在擬南芥和大麥的葉綠體中，whirly 1被證明與轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)緊密相關(guān),表明質(zhì)體定位的whirly1主要在RNA代謝中起作用，而不是單純作為DNA結(jié)合蛋白[14].此外，whirly 1被證明是玉米和擬南芥中質(zhì)體核的最豐富的蛋白質(zhì)之一[15].在擬南芥中，whirly 1是質(zhì)體基因組穩(wěn)定性所必需的[16]，并且在大麥中發(fā)現(xiàn)它可以壓縮核仁并調(diào)節(jié)質(zhì)體DNA拷貝數(shù)[17].大麥中的whirly 1蛋白被鑒定為衰老相關(guān)基因HvS40的潛在調(diào)節(jié)因子[18].當(dāng)植物在低光強(qiáng)度下生長時，野生型和RNAi-WHY1植物之間的衰老進(jìn)程相似.同樣，黑暗誘導(dǎo)的離體葉片的衰老不受whirly 1減少的影響.然而，當(dāng)植物在高光強(qiáng)度下生長時，在野生型植物中過早誘導(dǎo)衰老，但在RNAi-WHY1植物中延遲.該結(jié)果表明，whirly 1在葉綠體和細(xì)胞核之間的光傳感或應(yīng)激通訊中起作用.干旱處理加速了野生型植物的葉片衰老，而RNAi-WHY1顯示出持綠的表型.衰老相關(guān)基因和干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植物中被延遲[19].單鏈DNA結(jié)合蛋白whirly 1在擬南芥的葉片衰老過程中以發(fā)育階段依賴性方式作為WRKY53的上游抑制劑起作用[20]，WHY1突變體表現(xiàn)出早衰的表型.在該背景下，WRKY53和衰老相關(guān)蛋白酶基因SAG12的表達(dá)水平增加.whirly 1的雙重定位使其成為研究在正常葉片發(fā)育和各種脅迫情況下將信號從葉綠體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的候選基因.本研究以秈稻品系金23B的cDNA為模板，克隆得到水稻whirly 1基因(OsWHY1)序列，對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.分別構(gòu)建了OsWHY1過表達(dá)載體和干擾載體并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，為進(jìn)一步研究該基因在水稻持綠性中的作用打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料水稻品系金23B由本實(shí)驗(yàn)保存.選擇生長健康的水稻葉片為材料，于-80 ℃保存.植物表達(dá)載體pU1300，PTCK303由本實(shí)驗(yàn)室保存.克隆載體pClone007 Blunt Vector和大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自擎科生物技術(shù)公司.EasyTaq DNA Polymerase，T4 DNA連接酶購自全式金生物公司.Eastep Super總RNA提取試劑盒，GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega生物公司.普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化有限公司.BamHⅠ，SacⅠ，KpnⅠ，SpeⅠ購自諾唯贊生物公司.EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司.氨芐霉素，卡那霉素，利福平購自生工生物工程股份有限公司.

1.2 RNA提取及cDNA合成金23B的葉片總RNA的提取方法參考Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書，用于PCR的cDNA合成方法詳見GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書.

1.3OsWHY1基因的克隆及干擾片段的擴(kuò)增根據(jù)NCBI上水稻W(wǎng)HY1預(yù)測序列，設(shè)計引物QC(表1)，以金23B cDNA為模板擴(kuò)增WHY1基因序列.PCR用EasyTaq DNA Polymerase，反應(yīng)程序詳見說明書，Tm值60 ℃，延伸時間1 min.經(jīng)凝膠電泳后，切下目的片段，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行回收.回收片段連接克隆載體pClone007 Blunt Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取菌落進(jìn)行陽性鑒定，然后送武漢擎科生物公司進(jìn)行測序.利用WHY1基因編碼序列(coding sequence，CDS)引物(表1)以WHY1基因克隆質(zhì)粒為模板擴(kuò)增CDS，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；選取WHY1基因起始密碼子到360 bp的片段作為干擾靶序列，設(shè)計添加有酶切位點(diǎn)的引物(表1).分別以WHY1基因克隆載體質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增RNAi正反片段并連接到pClone007 Blunt Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.

1.4 生物信息學(xué)分析利用NCBI上的ORFfinder查找OsWHY1基因的開放閱讀框，并對其蛋白序列進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用ExPASy-ProtScale分析預(yù)測的蛋白序列；利用TMHMM對蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜分析；利用SWISS-MODEL軟件在線預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；利用NCBI上的protein blast搜索蛋白質(zhì)同源序列；利用MEGA7.0根據(jù)neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAMAN進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對.

1.5 基因表達(dá)載體構(gòu)建提取OsWHY1 CDS序列與干擾片段克隆載體質(zhì)粒.用BamHⅠ與SacⅠ酶切OsWHY1 CDS序列質(zhì)粒與pU1300質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測后切取目的條帶用試劑盒回收，用T4連接酶按說明書配置體系(37 ℃反應(yīng)30 min)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行陽性鑒定后，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR與酶切鑒定，鑒定無誤后利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌加入50%甘油于-80 ℃保存.

表1 基因克隆及載體構(gòu)建引物信息

下劃線為酶切位點(diǎn)

M：DL2000 DNA Marker；1～4：金23B總RNA圖1 金23B總RNA凝膠電泳

M：DL2000 DNA Marker；1：OsWHY1基因圖2 水稻OsWHY1基因的PCR擴(kuò)增

用SacⅠ與SpeⅠ雙酶切正義鏈載體與PTCK303表達(dá)載體，回收片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒后用RS引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證.用KpnⅠ與BamHⅠ雙酶切反義鏈載體與連接有正義鏈的PTCK303表達(dá)載體，回收片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒后用RAS引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證與SacⅠ與BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證.利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌液加入50%甘油于-80 ℃保存.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻總RNA提取本研究提取金23B葉片的總RNA，用微量核酸測定儀測得RNA的濃度為500～900 ng/μL，其OD260/280在1.8到2.0之間，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA條帶完整，可以用于后續(xù)試驗(yàn)(圖1).

2.2OsWHY1基因cDNA序列克隆提取的金23B葉片總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增得到OsWHY1基因全長序列，片段大小為1 250 bp(圖2).連接克隆載體pClone007 Blunt Vector后進(jìn)行測序，與NCBI上預(yù)測的OsWHY1基因序列比對正確后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

2.3WHY1基因的生物信息學(xué)分析利用NCBI上的ORFfinder分析發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框長度為825 bp，編碼274個氨基酸.使用ExPASy-ProtScale軟件對編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子質(zhì)量為30.359 kD，等電點(diǎn)為9.41，不穩(wěn)定系數(shù)為61.15，平均親水系數(shù)為-0.423，是不穩(wěn)定的親水蛋白(圖3).使用TMHMM軟件分析OsWHY1蛋白的跨膜區(qū)，預(yù)測結(jié)果表明該蛋白無跨膜區(qū)域(圖4).使用NCBI上Conserved domains分析OsWHY1蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示OsWHY1具有whirly結(jié)構(gòu)域，屬于whirly超級家族成員(圖5).利用SWISS-MODEL軟件在線預(yù)測并構(gòu)建OsWHY1蛋白的三級結(jié)構(gòu)，其主要結(jié)構(gòu)由α-螺旋和β-折疊組成(圖6).根據(jù)OsWHY1基因編碼的蛋白質(zhì)序列，在NCBI上用protein blast搜索并下載多個物種的WHY1基因同源序列.利用MEGA7.0構(gòu)建WHY1基因進(jìn)化樹，結(jié)果表明秈稻與粳稻的親緣關(guān)系最近，其次是野生稻(圖7).選取6個與OsWHY1相似性較高的物種利用DNAMAN進(jìn)行序列比對，結(jié)果如圖8所示，秈稻(Oryzasativaindica)OsWHY1蛋白與粳稻(Oryzasativajaponica)、玉米(Zeamays)、小米(Setariaitalica)、黍(Panicummiliaceum)、高粱(Sorghumbicolor)、大麥(Hordeumvulgare)的相似性分別是99.6%、79.8%、83.1%、82.7%、78.7%和75.3%.

圖3 OsWHY1蛋白親疏水性分析

圖4 OsWHY1蛋白跨膜區(qū)分析

圖5 OsWHY1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖6 OsWHY1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型

2.4OsWHY1超表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計帶有BamHⅠ與SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物，以O(shè)sWHY1基因克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增WHY1基因CDS序列(圖9)，連接克隆載體.用BamHⅠ與SacⅠ雙酶切該載體與表達(dá)載體pU1300(非空載)(圖10)，回收片段后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證(圖11)，送公司測序，測序結(jié)果正確后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并對菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖12).

2.5OsWHY1干擾載體構(gòu)建分別設(shè)計帶有KpnⅠ與BamHⅠ酶切位點(diǎn)、SacⅠ與SpeⅠ酶切位點(diǎn)的引物，以O(shè)sWHY1基因克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增360 bp干擾片段的正反鏈(圖13)，連接克隆載體.用SacⅠ與SpeⅠ雙酶切正義鏈載體(OsWHY1-RNAi-S)與PTCK303表達(dá)載體(圖14)，回收片段后用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用RS引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖15).用KpnⅠ與BamHⅠ雙酶切反義鏈載體(OsWHY1-RNAi-AS)(圖16)與連接有正義鏈的PTCK303表達(dá)載體(PTCK303-RNAi-S)，回收片段后用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用RAS引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖17).構(gòu)建好的載體(PTCK303-OsWHY1)用SacⅠ與BamHⅠ雙酶切檢測(圖18)，然后送公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105并對菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖19).

圖7 OsWHY1與其他物種WHY1蛋白進(jìn)化樹分析

M：100 bp DNA Marker；1～2：OsWHY1基因CDS序列圖9 OsWHY1基因CDS序列PCR

M：100 bp DNA Marker；1：pU1300表達(dá)載體雙酶切；2：OsWHY1基因CDS序列克隆載體雙酶切圖10 pU1300表達(dá)載體與OsWHY1基因CDS序列T載BamHⅠ與SacⅠ雙酶切

M：100 bp DNA Marker；1：pU1300-OsWHY1表達(dá)載體；2：雙酶切pU1300-OsWHY1表達(dá)載體圖11 pU1300-OsWHY1表達(dá)載體BamHⅠ與SacⅠ雙酶切驗(yàn)證

圖8 OsWHY1與其他物種WHY1蛋白序列比對

M：100 bp DNA Marker；1：pU1300-OsWHY1農(nóng)桿菌PCR圖12 pU1300-OsWHY1農(nóng)桿菌PCR檢測

M：100 bp DNA Marker；1：OsWHY1干擾片段正義鏈；2：OsWHY1干擾片段反義鏈圖13 OsWHY1干擾片段正反鏈PCR

M：100 bp DNA Marker；1：OsWHY1-RNAi-S質(zhì)粒雙酶切；2：PTCK303表達(dá)載體雙酶切圖14 PTCK303表達(dá)載體與OsWHY1-RNAi-S質(zhì)粒SacⅠ與SpeⅠ雙酶切

M：100 bp DNA Marker；1：PTCK303；2：PTCK303-RNAi-S圖15 PTCK303-RNAi-S與PTCK303 PCR檢測

M：100 bp DNA Marker；1：OsWHY1-RNAi-AS質(zhì)粒雙酶切圖16 OsWHY1-RNAi-AS質(zhì)粒KpnⅠ與BamHⅠ雙酶切

M：100 bp DNA Marker；1：PTCK303；2：PTCK303-OsWHY1圖17 PTCK303-OsWHY1表達(dá)載體與PTCK303 PCR檢測

M：DL2000 DNA Marker；1～2：PTCK303-OsWHY1表達(dá)載體雙酶切圖18 PTCK303-OsWHY1表達(dá)載體SacⅠ與BamHⅠ雙酶切檢測

M：DL2000 DNA Marker；1：PTCK303-OsWHY1質(zhì)粒RS引物PCR；2～3：PTCK303-OsWHY1農(nóng)桿菌RS引物PCR；4：PTCK303-OsWHY1質(zhì)粒RAS引物PCR；5～6：PTCK303-OsWHY1農(nóng)桿菌RAS引物PCR圖19 PTCK303-OsWHY1農(nóng)桿菌PCR檢測

3 討論

Whirly 1在植物中被廣泛研究，作為一種DNA單鏈結(jié)合蛋白，它具有多種功能.而作為一種細(xì)胞核與葉綠體雙重定位的蛋白質(zhì)，它也是研究葉綠體與細(xì)胞核之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有效工具.到目前為止WHY1基因在水稻中的功能研究較少，OsWHY1基因的具體功能尚不清楚.本研究通過蛋白質(zhì)同源序列比對發(fā)現(xiàn)whirly 1蛋白在各物種中的氨基酸序列相對保守，猜想OsWHY1可能具有與大麥和擬南芥WHY1基因相同的功能.構(gòu)建超表達(dá)載體與RNA干擾載體并轉(zhuǎn)化到個體中來改變基因的表達(dá)量是研究基因功能的常用手段.本研究成功構(gòu)建了OsWHY1基因超表達(dá)與干擾載體，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，而OsWHY1基因?qū)λ境志G性的影響還需要通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)植株中進(jìn)行驗(yàn)證，為探索OsWHY1基因在水稻持綠性方面的作用提供幫助.