生物催化合成手性胺的研究進展

劉婉頤, 鄧國忠*, 崔寶東, 鐘永科

(1. 遵義醫(yī)科大學 a. 藥學院； b. 貴州省生物催化與手性合成重點實驗室， 貴州 遵義 563000)

手性胺類化合物是多種藥物活性分子的重要結構單元，在生物醫(yī)藥和農用化學品中扮演著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計，許多手性藥物分子都含有手性胺的分子骨架，如卡巴拉汀(1a)、達泊西汀(2a)、加雷沙星(3a)等(Chart 1)[1]。此外，手性胺還可以作為重要的手性配體[2]。在傳統(tǒng)的合成方法中，手性胺的合成主要依賴于烯胺還原、酰胺還原、亞胺還原及不對稱轉移氫化等[3]，常用的催化劑以有機小分子催化劑和金屬催化劑為主，小分子催化劑如手性磷酸、手性雙烯-硼烷，金屬催化劑鈀、鈦、銠、鈷等[4]。

Scheme 1

近年來，生物催化因具有反應條件溫和、選擇性高和環(huán)境友好等特點，不斷應用于手性胺類藥物分子及其中間體的合成應用之中[5-6]。自然界提供了物種豐富的生物酶庫，為手性藥物分子的合成應用和工業(yè)生產(chǎn)提供了物質基礎。隨著DNA測序、DNA重組和酶蛋白的定向進化等生物技術的快速發(fā)展，越來越多的生物催化劑在化學反應中有了更優(yōu)異的表現(xiàn)[7]，而生物催化合成手性胺的方法也不斷涌現(xiàn)。本文綜述了近年來不同生物酶在手性胺酶法合成中的應用。

Scheme 2

Chart 1

脂肪酶(Lipase)來源于羧基酯水解酶家族，能夠催化酯鍵和酰胺鍵的斷裂或形成。脂肪酶具有多種催化活性，不僅可以催化拆分外消旋醇類、酸類、胺類和酯類，而且可以催化酯水解、胺解、酯交換等反應[10]。脂肪酶催化手性胺的合成策略一般是以外消旋的胺(4a)合成外消旋的酰胺或酯，再進行動力學拆分得到手性胺(4b, Scheme 1)[5]。

1996年，Kohls[11]課題組首次報道了以脂肪酶作為生物催化劑對手性胺進行動力學拆分。90年代初期，脂肪酶在工業(yè)上開始得到廣泛的應用，拜耳公司利用lipase B對α-甲基芐胺進行了動力學拆分。2010年，SUN[13]課題組利用脂肪酶Novozyme 435對2-庚胺(5a)進行動力學拆分，得到了99%的ee值和收率48.9%的(S)-5b(Scheme 2)。

2011年，Munoz[14]課題組利用脂肪酶為催化劑合成高對映選擇性的苯乙胺。2013年De Miranda[15]課題組報道了使用丙烯酸樹脂固定的Novozyme 435脂肪酶作為生物催化劑，對1-苯乙胺(6a)進行酯化拆分，得到(S)-構型的苯乙胺(6b， Scheme 3)，催化底物濃度高達900 mM，其固定化酶可以進行9次有效循環(huán)仍保持較高催化活性；發(fā)現(xiàn)在不同?；w下，該反應的轉化率為31%～57%不等。溫和條件下，當以2-甲氧基乙酸甲酯或乙酸乙酯作為酰基供體時，該反應體現(xiàn)出優(yōu)異的對映選擇性，E值可達200以上，但隨著反應溫度的升高E值呈現(xiàn)下降的趨勢。

Scheme 3

Scheme 4

轉氨酶(Transaminases， TAs)是一類5′-磷酸吡哆醛(PLP)依賴性轉移酶，能夠可逆催化酮基與氨基間的立體選擇性轉移，其普遍存在于植物、微生物以及動物的心肌、腦、肝、腎等組織中[5]。轉氨酶根據(jù)氨基轉移位置的不同，大致可分為α-轉氨酶和ω-轉氨酶兩大類，當催化的反應底物或產(chǎn)物中含有α-氨基酸時稱之為α-轉氨酶，含有ω氨基酸則為ω-轉氨酶[16]。α-轉氨酶的產(chǎn)物較為單一，通常僅為α-氨基酸，而ω-轉氨酶因其可以催化酮、醛等不對稱氨基轉移從而在醫(yī)藥合成中得到更加廣泛的應用[17]。轉氨酶在催化反應過程中不需要昂貴的輔因子參與反應，可將酮或醛(7a)與氨基供體反應生成手性胺類化合物(7b,Scheme 4),但其催化活性易受到底物抑制和產(chǎn)物抑制，并且底物范圍相對較窄[9]?？赡娣磻拇嬖谑菍⑼惖孜镛D化為手性胺的主要障礙，而去除副產(chǎn)物丙酮酸可改善這種不利的熱力學不平衡[18]。轉氨酶用于手性胺合成的方法大致分為三類：(1)外消旋體的動力學拆分；(2)前手性酮的不對稱轉化；(3)外消旋底物的轉化[19](圖1)。在90年代初期，STIRLING DAVID等[20]就報道了(R)-構型和(S)-構型的轉氨酶，能夠將酮類底物氨基化為手性苯甲胺，收率均在90%以上。

Scheme 5

圖 1 轉氨酶合成手性胺的策略

2010年，Savile等[21]以轉氨酶為生物催化劑，取代銠催化烯胺進行不對稱加氫合成手性胺，用于工業(yè)化生產(chǎn)抗糖尿病藥物西他列汀(8c)，這是生物催化在工業(yè)生產(chǎn)上的重大突破，也標志著生物催化在合成手性胺類藥物活性分子中的合成應用(Scheme 5)。

2015年，Chen課題組克隆表達了一種來自熱脫硝桿菌的(S)-構型選擇性的ω-轉氨酶TPTAgth，在pH 9.0和65 ℃下仍可以保持高活性，表現(xiàn)出良好的耐熱性和強堿環(huán)境耐受性，且該酶對酮糖具有良好的催化活性。

2016年，PAVLIDIS等在取代基空間位阻較大的結構方面得到了較大進展，能夠將體積較大的酮轉化為相應的手性胺(9a～14a)，其收率最高可達82%，ee值可達99%以上，表現(xiàn)出優(yōu)秀的對映選擇性(Chart 2)。

Chart 2

2016年，Wu課題組[24]發(fā)現(xiàn)了4個來自假單胞菌的(R)-構型選擇性ω-TAs，其中PpspuC通過動力學拆分外消旋2-苯甘氨醇(15a)得到ee值高于99%的(S)-2-苯甘氨醇(15b)(Scheme 6)。2019年該課題組克隆表達了來自節(jié)桿菌屬的(R)-構型選擇性ω-TAs(MVTA)，可以對大體積的β-氨基醇進行動力學拆分，其產(chǎn)物的ee值大于99%[25]。

Scheme 6

Scheme 7

在之前的報道中，絕大部分轉氨酶屬于(S)-構型選擇，報道的(R)-構型選擇的轉氨酶較少，只有一種來自節(jié)桿菌屬的轉氨酶被設計來轉化大基團的酮。2016年,Guan課題組[28]報道了對來自節(jié)桿菌屬的(R)-轉氨酶的晶體結構分析，為此類轉氨酶的結構修飾改造、定向進化提供了結構基礎和理論依據(jù)，并為新型手性胺類化合物合成途徑的設計奠定了基礎。

Chart 3

Scheme 8

單胺氧化酶(Monoamine oxidases， MAOs)屬于黃素腺嘌呤核苷酸(FAD)依賴的胺氧化還原酶類，催化由氧驅動的胺向相應的亞胺轉化，并生成副產(chǎn)物過氧化氫。由于單胺氧化酶的高立體選擇性識別，通常只選擇將單一構型的對映異構體進行轉化，從而將消旋的手性胺去消旋化而獲得單一構型的產(chǎn)物。1995年，來自Asoergillusniger的單胺氧化酶首次被發(fā)現(xiàn)并命名為MAO-N[30]。2002年，Alexeeva課題組[31]報道了利用MAO-N為生物催化劑，通過MAO-N催化的氧化拆分反應制備手性胺的新策略。

2013年，Ghislieri課題組[32]利用MAO-N為生物催化劑，對四氫-β-咔啉(16a)結構進行了去消旋化反應，并得到ee值為99%和93%的單一構型產(chǎn)物(16b, Scheme 7)。該課題組進一步對MAO-N進行定向進化，擴大了含有芳基取代的手性胺底物譜(17a～29a, Chart 3)[7]。2018年，該課題組對單胺氧化酶可催化的底物范圍進行了總結，其中突變體D5、 D9、 D11具有較高的活性，其底物范圍覆蓋了α-取代的甲基苯胺、聯(lián)苯胺和1,2,3,4-四氫喹啉等不同結構的伯胺、仲胺、叔胺化合物。

2016年，本課題組發(fā)現(xiàn)蒙氏假單胞菌ZMU-T01的整細胞對四氫喹啉(30a)類化合物具有氧化拆分活性，以此菌株整細胞作為生物催化劑能對2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉(31a)進行氧化拆分，并以最高99%的ee值和50%的收率獲得(R)-構型產(chǎn)物。該菌株整細胞對2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉類底物普適性較好，但對于苯環(huán)含有取代基的底物適應性表現(xiàn)不佳[34]。2018年，本課題組從蒙氏假單胞菌ZMU-T01中克隆表達了一株新的單胺氧化酶MAO5，構建相應基因工程菌，通過整細胞生物催化反應實現(xiàn)苯環(huán)取代的2-甲基-1,2,3,4-四氫喹啉(32a)類化合物的高對映選擇性氧化拆分，對多種底物表現(xiàn)出優(yōu)異的立體選擇性，ee值可達99%及以上(Scheme 8)[35]。

2016年，Li課題組利用來自短桿菌IH-35A的環(huán)己胺氧化酶(Cyclohexylamine oxidase， CHAO)為生物催化劑，對外消旋胺進行動態(tài)動力學拆分去消旋。野生型的CHAO對腫胺和叔胺均表現(xiàn)為低活性或無活性，但通過對CHAO進行定向進化，使其對2-取代-1,2,3,4-四氫喹啉類化合物可進行有效的動態(tài)動力學拆分，并得到了高達99%的ee值和76%的收率。他們對CHAO進一步研究并對其晶體結構進行分析，通過定向進化，拓展該酶的底物結合口袋，成功篩選到突變體，可以有效催化2-位取代基為大基團的底物，并具有較高的對映選擇性[37]。2018年，朱敦明課題組與Reetz教授課題組合作共同對MAO-N進行改造，使其對1,2,3,4-四氫-1-取代異喹啉、2-苯基吡咯啉等(33a～37a)底物都有較好的底物適應性，并且表現(xiàn)出較好的對映選擇性和催化活性[38]。

亞胺還原酶(Imine reductase， IRED)是一種依賴NAD(P)H的氧化還原酶，可以催化前手性亞胺不對稱還原為相應的胺，具有高度立體選擇性[39]。除單胺氧化酶可用于廣泛結構的手性胺的合成外，其余大多數(shù)生物催化劑只能產(chǎn)生一級胺，不能直接生成二級胺或三級胺，轉氨酶和氨脫氫酶都僅限于將氨基轉移至羰基上，對于手性仲胺和叔胺的合成是難以實現(xiàn)的。而亞胺還原酶可以通過不對稱氫化還原為這些手性胺化合物提供新的合成方法。亞胺還原酶雖然能催化反應生成手性胺，但其對映選擇性較低，并需要大量的生物催化劑加入[42-43]。2010年，Mitsukura等[44]報道了來自鏈霉菌屬的亞胺還原酶GF3587能夠將2-甲基吡咯啉(38a)還原為相應的(R)-2-甲基吡咯烷(38b)。 2011年，該課題組將另一種亞胺還原酶GF3546進行純化表征和表達，能夠催化生成(S)-2-甲基吡咯烷(38c， Scheme 9)，其催化活性為野生型的兩倍[45]。

Scheme 9

2013年，Leipold課題組[46]將亞胺還原酶GF3546過表達于大腸桿菌宿主中，其催化底物普適性得到提升，可以對映選擇性還原一系列不同的亞胺，包括2-取代環(huán)亞胺，二氫異喹啉等。2015年，該課題組將GF3587過度表達于大腸桿菌中，其催化活性得到了較大提升[40]。同年，聯(lián)合亞胺還原酶((R)-IRED)和單胺氧化酶(MAO-N)對外消旋雜環(huán)胺(39a)進行動態(tài)動力學拆分，得到ee值>99%手性的雜環(huán)胺(39c， Scheme 10)[47]。 MAO和IRED共同作用時可用于手性胺的動態(tài)動力學拆分，而這種雙酶級聯(lián)催化反應體系避免了MAO在催化胺類化合物動態(tài)動力學拆分過程中化學還原劑的使用，如氨硼烷。

Scheme 10

Scheme 11

2018年，Velikogne課題組[39]將亞胺還原酶與醇脫氫酶進行共表達后得的菌株，通過醇脫氫酶在NADP+作為輔因子下可氧化脫氫2-丙醇生成丙酮，并得到亞胺還原酶完成亞胺還原反應所需的NADPH，從而達到輔因子循環(huán)。在不添加其他輔因子的條件下，底物濃度可提升至100 mM，為克級制備光學純手性胺提供了一種綠色、高效且經(jīng)濟的方法。

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

Scheme 15

胺脫氫酶(Amine dehydrogenase， AmDH)是一種能夠催化酮的不對稱還原胺化反應的生物酶，且副產(chǎn)物僅有水。早在1968年Eady等[48]就對甲胺脫氫酶進行了純化表征，但其不能依賴NAD+或NADP+為電子受體，并且僅能氧化脂肪族的單胺、二胺、組胺，不能氧化仲胺、叔胺和季胺鹽。2000年，Itoh等[49]對來自鏈霉菌中的胺脫氫酶進行分離純化表征，并構建了它的催化底物范圍，不僅能催化胺的可逆氧化脫胺反應，還能催化氨基醇和氨基酸的可逆脫胺反應，但催化效率和對映選擇性都不高；但此次構建的氨脫氫酶基因工程菌可以依賴NAD+或NADP+進行電子傳遞，而之前所報道的此類酶均需要人工電子受體。2012年，Abrahamson[50]課題組對來自芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶進行定向進化，開發(fā)了一種新的氨脫氫酶，具有較高的催化活性，能催化4-甲基-2-氧代戊酸(41a)和甲基異丁基酮(42a)生成相應的手性胺(41b,42b, Scheme 11)，ee值達到99%。

2015年，Ye課題組[51]發(fā)現(xiàn)了來自紅球菌屬的苯丙胺酸脫氫酶通過定向進化得到的三突變體K66Q/S149G/N262C(TM_PheDH)是具有高度對映選擇性的生物催化劑，能選擇性地還原苯基丙酮(42a)和4-苯基-2-丁酮(43a)，得到ee值高達98%的(R)-安非他明(42b)和(R)-1-甲基-3-苯基丙胺(43b, Scheme 12)。

Scheme 16

2016年，Abrahamson課題組[50]開發(fā)了3個胺脫氫酶與甲酸脫氫酶協(xié)同作用，可對各類芳香族和脂肪族的酮類及醛類進行還原胺化，其催化的底物濃度高達50 mM，同時達到99%的ee值，利用此雙酶體系進行還原胺化，僅生成無機碳酸鹽為唯一副產(chǎn)物。并在他的研究中證明了單一氨脫氫酶不能接受不同類型的底物，如Ch1-AmDH對脂肪族酮和苯乙酮(44a)有較高的活性，Rs-PhAmDH對苯丙酮衍生物(45a)及空間位阻較大的酮有較高的活性(Scheme 13)。

2017年，Ye課題組[51]利用苯丙氨酸脫氫酶對苯氧基-2-丁酮(46a)進行還原胺化得到(R)-1-苯氧基-2-丙胺(46b, Scheme14)，其底物濃度可以達400 mM，產(chǎn)物ee值>99%，轉化率為96%。

細胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是自然界用途最廣泛的生物催化劑，具有催化反應類型多樣性和底物多樣性[52]?？梢源呋喾N底物的區(qū)域選擇性和立體選擇性氧化反應，并參與多種天然產(chǎn)物的生物合成[53]。

早在1985年就曾有利用P450酶催化氮原子的功能化轉移報道，這是P450在胺類化合物合成中較早的應用[54]。2013年，Mcintosh課題組[53]報道了用于C—H胺化的高活性酶催化劑，對P450BM3的T268A和C400S殘基突變后獲得P450BM3變種酶P411，其對C—H胺化的催化活性得到了巨大提升，能催化2,4,6-三乙基苯磺酰疊氮(47a, Scheme 15)生成環(huán)狀手性胺(47b)(Scheme 15)，ee值為87%，分離收率69%。

2016年，Prier課題組[55]繼續(xù)以P411突變體為生物催化劑，利用σ重排進行烯丙基胺的不對稱酶法合成。2019年，該課題組繼續(xù)以P411為模板進行突變，構建了一個可以用于一級(48a)，二級(49a)和三級(50a, Scheme 16)C—H不對稱胺化的酶庫，并在吸電子基和給電子基以及空間位阻的影響下都具有良好的底物普適性[56]。

手性胺作為藥物合成中的重要骨架分子，在新藥研發(fā)和天然藥物化學結構中都具有重要的意義。近些年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，使得生物酶定向進化、理性設計等技術愈發(fā)成熟?？梢愿鶕?jù)不同的化學反應設計所需的生物酶，尤其在區(qū)域選擇性、對映選擇性控制以及不活潑位點的活化方面取得顯著提升?，F(xiàn)階段所發(fā)現(xiàn)的脂肪酶、轉氨酶、單胺氧化酶、亞胺還原酶、胺脫氫酶以及P450酶已經(jīng)能在不同類型的手性胺合成中具有一定的特點和優(yōu)勢。但目前仍然存在新酶發(fā)現(xiàn)不足，底物普適性不高、熱穩(wěn)定及有機溶劑耐受性有限等問題，這些問題也是指導手性胺類藥物分子重要中間體生物催化合成發(fā)展的重要方向。