董雪潔,宋 平,呂俊文,3*,鄧晨陽

(1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.湖南省核工業(yè)中心實驗室,湖南 長沙 410100;3.衡陽市土壤污染控制與修復(fù)重點(diǎn)實驗室,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

鈾是自然界中原子量最大的元素，隨著核技術(shù)的快速發(fā)展，鈾的應(yīng)用越來越廣泛。鈾資源的采冶和利用過程中產(chǎn)生了大量的含鈾工業(yè)廢水，對生態(tài)環(huán)境造成的影響不容忽視[1]。如何解決土壤重金屬污染一直是研究熱點(diǎn)問題。微生物修復(fù)土壤重金屬污染因其經(jīng)濟(jì)、高效和無二次污染等優(yōu)勢引發(fā)了關(guān)注[2]。

胞外聚合產(chǎn)物(extracellular polymeric substances，EPS)是微生物在新陳代謝過程中產(chǎn)生的成分復(fù)雜的生物聚合物質(zhì)[3]。EPS的存在能保護(hù)微生物，降低重金屬對胞體的毒害[4]。S.K.Kazy等人研究了銅綠假單胞菌胞外多糖結(jié)合銅，認(rèn)為EPS在重金屬污染修復(fù)中有較大的應(yīng)用潛力[5]。C.Dang等人發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌株P(guān)TN31在去除EPS后對Pb2+的吸附能力下降了40.9%～66.8%[6]。R.Chug等人從A.beijreinckii(MTCC-2641)和B.subtilis(MTCC-8363)兩種細(xì)菌上提取EPS，發(fā)現(xiàn)在EPS結(jié)合Cr(VI)的過程中羥基和磷酸基團(tuán)起了重要作用[7]。洪晨等人發(fā)現(xiàn)土壤芽孢桿菌產(chǎn)生的EPS吸附Pb2+在溫度為35 ℃和pH為5時有最佳的吸附效果[8]。已有的研究表明了EPS在重金屬污染修復(fù)方面具有的積極作用，然而對于土壤細(xì)菌產(chǎn)生的EPS與鈾之間的相互作用機(jī)制仍不太清楚。探究土壤細(xì)菌胞外聚合物(soil bacterial extracellular polymeric substances，SB-EPS)去除溶液中U(VI)的動力學(xué)有助于揭示SB-EPS與U(VI)之間的結(jié)合機(jī)制和進(jìn)一步開展土壤細(xì)菌修復(fù)鈾污染的研究。

本研究中，SB-EPS提取自中國南方土壤培養(yǎng)的土壤細(xì)菌，開展了溫度對土壤細(xì)菌和SB-EPS的產(chǎn)量的影響實驗，和時間對不同溫度下SB-EPS去除U(VI)的影響實驗，并使用準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程進(jìn)行動力學(xué)分析。旨在為微生物修復(fù)土壤鈾污染的研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

高壓滅菌鍋(GI54T)；真空冷凍干燥機(jī)(FD5-series)；高速臺式離心機(jī)(TGL-15B)；超低溫冰箱(MDF-U32U)；空氣恒溫震蕩箱(IS-RDD3)；鼓風(fēng)干燥箱(101-3AB)；電子天平(BSA2245-CW)；超凈臺(SW-CJ-1FD)，U3O8，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，HNO3，NaOH，HCl，三氯化鈦，偏釩酸銨，硫酸亞鐵銨和二苯磺氨酸鈉等藥品試劑均為分析純。另有微孔濾膜(0.22 μm)，錐形瓶，20 mL注射器，酒精燈，量筒等。

土壤取自中國南方典型林間土壤，采集到的新鮮土樣放入無菌樣品袋(樣品袋放置在無菌工作臺內(nèi)用紫外燈照射35 min以上)，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤細(xì)菌培養(yǎng)

培養(yǎng)基使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨10 g/L；用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2[9-10]。培養(yǎng)基配置完成后裝入錐形瓶內(nèi)，裝入量不宜超過二分之一。錐形瓶蓋好封口膜并用橡皮筋綁緊，放入高溫蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌。

土壤細(xì)菌的培養(yǎng)和擴(kuò)培在無菌工作臺上操作：取適量土壤制備成土壤懸濁液，后用接種環(huán)取適量土壤懸濁液接種至滅菌后的培養(yǎng)基內(nèi)，放入恒溫震蕩箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 SB-EPS的提取和產(chǎn)量實驗

SB-EPS的提取方法有離心法、NaOH法、熱處理法、超聲波法和萃取法等[11]。實驗選擇先使用超聲波+高速離心法提取SB-EPS[12]。先使用超聲波對菌液處理兩分鐘，然后在10 000 r/min下離心，使用20 mL注射器吸取上清液用微孔濾膜過濾并放入-50 ℃的環(huán)境中冷凍24 h。取出冷凍處理后的上清液放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)處理。

溫度對土壤細(xì)菌產(chǎn)量和SB-EPS產(chǎn)量影響實驗：

1)分別在若干個錐形瓶中加入等量的培養(yǎng)基，滅菌后在超凈臺中進(jìn)行土壤細(xì)菌的接種；2)將接種后的培養(yǎng)基放入空氣恒溫震蕩箱內(nèi)，在293 K、298 K、303 K、308 K和313 K培養(yǎng)48 h；3)按照超聲波+高速離心法提取SB-EPS，菌體用無菌水沖洗并過濾，通過冷凍干燥除去水分；4)稱量提取得到的SB-EPS和菌體的質(zhì)量，其中土壤細(xì)菌同樣通過冷凍干燥除去水分。

1.2.3 吸附動力學(xué)分析實驗

研究采用靜態(tài)搖床實驗的方式，測試在298 K、308 K和318 K的溫度下，時間對SB-EPS去除U(VI)影響的實驗。初始U(VI)濃度為50 mg/L，pH為5，SB-EPS加入量為3.33 g/L，去除量計算方程如下式所示：

Q=v(C0-Ct)/m

式中：Q為反應(yīng)后U(VI)的去除量，mg/g；v為測試溶液體積(L)；C0為U(VI)初始質(zhì)量濃度，mg/g；Ct為反應(yīng)后溶液中U(VI)濃度，mg/g；m為SB-EPS加入質(zhì)量，g。

吸附動力學(xué)能反映SB-EPS與U(VI)之間存在的反應(yīng)機(jī)制。為了能更全面的描述該吸附過程，對不同溫度下SB-EPS去除鈾的實驗進(jìn)行動力學(xué)分析采用了準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程。兩種動力學(xué)方程的公式[13]和所描述的反應(yīng)過程見表1。

表1 動力學(xué)方程公式及意義

注：Qb為當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時U(VI)的去除量，mg/g；t為SB-EPS和U(VI)的反應(yīng)接觸時間，min；Qt為反應(yīng)進(jìn)行到t時U(VI)的去除量，mg/g；K1和K2均為方程常數(shù)。

1.3 分析方法

溶液中U(VI)含量的測定方法采用釩酸銨滴定法[14]。

2 分析與討論

2.1 SB-EPS與土壤細(xì)菌的產(chǎn)量實驗

溫度對土壤細(xì)菌和SB-EPS的產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖1所示當(dāng)溫度逐漸升高，SB-EPS的產(chǎn)量也在增加。當(dāng)溫度為313 K時，SB-EPS產(chǎn)量達(dá)到了12.75 g/L。從SB-EPS產(chǎn)量對溫度的柱狀圖來看，溫度越高SB-EPS的量也越高。然而通過土壤細(xì)菌菌體對溫度的柱狀圖中發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌的的產(chǎn)量在溫度范圍為293 K ～303 K時逐漸增加，在303 K～313 K時表現(xiàn)出了產(chǎn)量降低的現(xiàn)象。當(dāng)溫度為303 K時，土壤細(xì)菌菌體產(chǎn)量最高為1.58 g/L。

產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)溫度高于303 K時，環(huán)境溫度變得不適宜土壤細(xì)菌生長，導(dǎo)致出現(xiàn)較多的細(xì)菌死亡裂解，造成SB-EPS的產(chǎn)生量增加。同時，當(dāng)環(huán)境變惡劣時，細(xì)菌也會加速分泌EPS來抵御環(huán)境變化對胞體造成的侵害[15]。綜合考慮后，實驗在303 K下進(jìn)行土壤細(xì)菌的培養(yǎng)。

2.2 不同溫度與反應(yīng)時間對SB-EPS去除U(VI)的影響

在298 K、308 K、318 K三個溫度下，進(jìn)行在不同反應(yīng)接觸時間(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min)下SB-EPS去除 U(VI)的實驗。去除 U(VI)的時間曲線如圖2所示。當(dāng)反應(yīng)時間進(jìn)行到20 min，三個溫度下的U(VI)去除量差距并不大。反應(yīng)時間在20～110 min之間時，三個溫度下的U(VI)去除量差距變大但是曲線的走勢仍較為相似，這時可以明顯看出308 K溫度下的U(VI)去除量最高。反應(yīng)進(jìn)行了110 min后，三個溫度下的U(VI)去除量曲線逐漸變得平緩，反應(yīng)在120 min左右曲線趨于平衡，反應(yīng)平衡濃度分別為4.97 mg/L，8.75 mg/L和6.96 mg/L。一般來說，溫度的升高能增加SB-EPS與溶液中鈾酰粒子的單位時間內(nèi)的碰撞次數(shù)，從而使SB-EPS對U(VI)的去除量增加。而當(dāng)溫度為318 K時U(VI)的去除量相比于溫度為308 K時有所減少，這和SB-EPS本身的性質(zhì)有關(guān)。SB-EPS是生物聚合物質(zhì)，組分復(fù)雜，可能含有酶等對溫度變化敏感的生物大分子。有研究表明土壤酶隨溫度從低變高，其活性會先增強(qiáng)后減弱[16-17]。SB-EPS中可能含有土壤細(xì)菌胞外酶，并在308 K時的酶活性比在318 K時高。

2.3 吸附動力學(xué)研究

準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程是吸附動力學(xué)分析中較為常見的兩種方程。準(zhǔn)一級動力學(xué)方程建立在一種理想的反應(yīng)環(huán)境下，而準(zhǔn)二級動力學(xué)方程描述的反應(yīng)進(jìn)程則更為復(fù)雜。SB-EPS去除U(VI)的準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的分析處理結(jié)果如圖3所示，兩種動力學(xué)方程的擬合參數(shù)如表2所示。

不同的三個溫度下，準(zhǔn)一級動力學(xué)方程的R2值在0.8～0.9之間，準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的R2值均在0.95以上。這說明準(zhǔn)二級動力學(xué)方程與時間因素實驗數(shù)據(jù)有更好的線性關(guān)系。因而相對于準(zhǔn)一級動力學(xué)方程，使用準(zhǔn)二級動力學(xué)方程來描述SB-EPS和U(VI)之間的相互作用比較合適。這表明SB-EPS去除鈾是一個由化學(xué)反應(yīng)控制的過程，反應(yīng)中可能發(fā)生電子傳遞等機(jī)制。

表2 不同溫度下準(zhǔn)一級動力學(xué)方程和準(zhǔn)二級動力學(xué)方程的擬合參數(shù)

3 結(jié) 論

通過一系列靜態(tài)搖床實驗，本研究進(jìn)行了在不同溫度下SB-EPS和土壤細(xì)菌的產(chǎn)量實驗和SB-EPS去除U(VI)的實驗，并對實驗結(jié)果進(jìn)行了動力學(xué)分析，得到如下結(jié)論：

1)本研究中的土壤細(xì)菌較為適合在303 K下培養(yǎng)。

2)不同溫度下，時間對SB-EPS去除U(VI)的影響實驗在120 min左右達(dá)到反應(yīng)平衡，298 K、308 K、318 K時的反應(yīng)平衡濃度分別為4.97 mg/g，8.75 mg/g和6.96 mg/g。

3)準(zhǔn)一級動力學(xué)方程對實驗擬合結(jié)果較差，準(zhǔn)二級動力學(xué)方程對不同溫度下SB-EPS去除U(VI)的反應(yīng)都有較高的擬合度，動力學(xué)方程擬合結(jié)果表明SB-EPS去除鈾是一個由化學(xué)機(jī)制所控制的反應(yīng)。