吳艷瓊 張 熙 付學斌 李 均 王明霞

骨癌痛是腫瘤患者發(fā)生骨轉移時最常見的癥狀之一，伴有自發(fā)痛、痛覺過敏和痛覺超敏等特征，嚴重影響癌癥患者生存質量[1]。胍丁胺(agmatine，AGM)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的神經(jīng)遞質和/或調質，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在腦和脊髓中合成，主要參與內(nèi)臟活動、生長發(fā)育、降壓、認知和疼痛等作用[2-3]。目前，AGM對骨癌痛鎮(zhèn)痛作用及其機制的研究甚少。本研究擬通過構建大鼠脛骨骨癌痛模型，觀察AGM鞘內(nèi)注射對骨癌痛大鼠痛行為和脊髓CXCL13表達的影響，探討AGM對骨癌痛的鎮(zhèn)痛效果及可能機制，為臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雌性 SD 大鼠60只，體質量200～220 g，由湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心提供(合格證號43004700)。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，溫度22～24℃，濕度40%～60%。將預選合格的SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組: 假手術組(A 組)、骨癌痛組(B 組)、胍丁胺組(C 組)，每組20只。

1.2 骨癌痛模型建立 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉后，參照文獻[4-5]方法,縱行切開B、C組大鼠左脛骨上段皮膚，切口長度約0.5～1 cm，仔細暴露脛骨，取10 mL注射器針頭在脛骨粗隆平面處，與骨面夾角呈30°～45°，向尾部方向進行穿刺打孔，再用微量進樣器抽取Walker 256細胞懸液10 μL[6]，由穿刺孔進針緩慢注射至骨髓腔內(nèi),出針后迅速骨蠟封閉，無菌生理鹽水局部沖洗，縫合傷口,外涂紅霉素軟膏預防感染。A 組脛骨髓腔內(nèi)注射等量生理鹽水，其余處理同B、C兩組。造模后12天，取大鼠脛骨行HE染色，鑒定成模情況。

1.3 機械痛閾值測定 術前將大鼠置入機械刺激儀玻璃籠中，每天 30 min，連續(xù)3天，使其適應周圍環(huán)境及操作，于造模后12天測量其機械痛閾值。使用 von frey 纖維絲，垂直方向刺激大鼠左后肢足底中部，記錄儀自動記錄大鼠縮足反射閾值，連續(xù)測3次，每次間隔時間10 min，取平均值作為該時點機械痛閾值。

1.4 鞘內(nèi)置管和藥物注射 大鼠麻醉后剔除兩側髂嵴部位毛發(fā)，兩髂嵴連線為 L5～6 棘突水平，備皮部位消毒3 遍后置于手術臺上。于 L5 棘突水平切開皮膚，分離棘突間隙,咬骨鉗咬去 L5 椎體棘突，用1 mL 無菌注射器針頭將硬脊膜刺破后拔出針頭，將 PE-10 導管朝向頭端方向置入蛛網(wǎng)膜下腔，深度約 3 cm 處, 此部位為脊髓腰膨大水平(L1～L2)處，導管置入后見清亮腦脊液從導管流出，為確保導管通暢，用生理鹽水沖洗導管，沖洗后縫合固定導管。經(jīng)導管給予2%鹽酸利多卡因(D17G09Ⅱ, 山東華魯)10 μL，注入局麻藥后再用 10 μL 生理鹽水沖洗導管，保證藥物完全進入鞘內(nèi)。觀察大鼠注藥后的反應，若注藥 10 s后，雙側后肢出現(xiàn)拖地現(xiàn)象及運動障礙，約15 min后大鼠活動恢復自如，證明導管放置成功。A組不做鞘內(nèi)注射，B組和 C組分別經(jīng)導管注射等量0.9%生理鹽水和AGM 160 mg/kg(3 mg/μL)，10 s內(nèi)注射完，連續(xù)注射6天后進行相關指標檢測。

1.5 免疫熒光法檢測CXCLl3 在脊髓背角神經(jīng)元中表達 于建模后12天，痛閾測定結束后，取大鼠L4～L6脊髓，多聚甲醛固定,30%蔗糖脫水至完全沉底，連續(xù)冰凍切片(厚14 μm)，加入5%羊血清抗體封閉液，室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗后，同時加入兔源性單克隆CXCL13抗體(1∶500，美國Abcam公司，ab199043)和小鼠源性單克隆NeuN抗體(1∶1 000，美國Abcam公司，ab104224)，4℃孵育12 h后，PBS洗滌3次，加入相應熒光標記二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，熒光封片劑封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica sp8，德國)觀察CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元中的表達情況。

1.6 Western blot檢測脊髓CXCL13蛋白表達 造模后12天鞘內(nèi)注藥測痛閾值后，A、B、C 3組大鼠行斷頭處死，迅速取L4～L6脊髓，加細胞裂解緩沖液勻漿，分離提取總蛋白。 采用Lowry法進行蛋白定量，以50 μg蛋白上樣，經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉膜。將NC膜浸入5%脫脂奶粉室溫封膜1 h。洗膜3次后加入β-actin(1∶3 000，美國Abcam公司，ab179467)及兔源性單克隆CXCLl3抗體(1∶1 000)，洗膜3次后加入二抗(1∶5 000，美國Abcam公司，ab205718)，37℃孵育2 h ，最后用ECL顯像曝光。用灰度掃描儀檢測出相應CXCLl3條帶和β-actin內(nèi)參條帶的平均灰度值，用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比表示樣品中目的蛋白含量。

1.7 RT-PCR法測定CXCLl3 mRNA表達 造模后第12天，A、B、C 3組大鼠取L4-L6節(jié)段脊髓，遵循PCR引物設計原則，以GAPDH作為內(nèi)參。CXCLl3上游引物為: 5′-CTGCTCGGAATCTTAGTGT-3′，下游引物為: 5′-GGTAATGCGTCTGCTTCT-3′；GAPDH上游引物為: 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為: 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCACTA-3′。PCR擴增條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延長1 min，72℃ 再延長7 min。以2-△△CT方法計算CXCLl3 mRNA 的相對表達水平。

2 結果

2.1 模型的鑒定 造模后12天，取大鼠右側脛骨，經(jīng)HE染色，觀察到正常大鼠骨質致密，結構完整(圖1A)。大鼠脛骨骨髓腔移植腫瘤細胞后，出現(xiàn)明顯的骨質破壞(圖1B)。

圖1 大鼠脛骨HE染色(×100)

2.2 3組大鼠痛行為比較 建模后12天，B 、 C組大鼠機械縮足反射閾值均明顯低于A組；與B組比較,C 組機械縮足反射閾值高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表 1。

表1 3組大鼠機械痛閾值比較

2.2 CXCL13在大鼠脊髓背角神經(jīng)元中的表達比較 建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13表達增加，與B組比較,C 組大鼠CXCL13表達減少。見圖2。

2.3 CXCL13蛋白含量及其mRNA表達 建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13 蛋白及mRNA表達明顯增加，與B組比較, C組大鼠脊髓CXCL13 蛋白及mRNA表達減低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖3。

圖2 CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元的表達(免疫熒光雙標，×20)

表2 3組大鼠CXCL13 蛋白含量及其mRNA表達

圖3 3組大鼠CXCL13 蛋白表達情況

3 討論

骨癌痛是原發(fā)性或轉移性骨腫瘤引起的慢性疼痛，是癌癥患者晚期骨轉移后最常見的并發(fā)癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,癌癥患者中約1/3的惡性腫瘤會發(fā)生骨轉移。絕大部分骨腫瘤患者會出現(xiàn)不同程度的慢性疼痛。由于目前尚無確切治療方法，約50%的骨癌患者疼痛未得到有效控制。長期慢性疼痛給患者及其家人帶來巨大痛苦，嚴重影響患者生活質量。所以尋找有效的癌痛治療措施，是目前亟待解決的問題。

脛骨癌痛模型是進行癌痛研究的常見模型之一，通過將腫瘤細胞注射到脛骨骨髓腔內(nèi)，模擬骨轉移癌的病理學特征[6]，本實驗采用了癌細胞脛骨骨髓腔注射的方式建立癌痛模型，通過行為學檢測和脛骨病理切片檢測，證實了骨癌痛模型制備成功。

AGM是一種內(nèi)源性陽離子聚胺[3, 7]，幾乎分布于哺乳動物體內(nèi)的所有器官，可作用于哺乳動物神經(jīng)遞質系統(tǒng)，同時調控天冬氨酸、聚胺及一氧化氮合成與代謝，在機體病理生理改變及細胞修復機制中起著重要作用。研究[8]證實，AGM可顯著增加阿片類藥物的鎮(zhèn)痛強度，還能有效地預防和治療嗎啡的成癮性[9]；在神經(jīng)病理性疼痛模型中，AGM可呈劑量依賴性地增加大鼠機械痛閾值[10-11]。本實驗建立大鼠骨癌痛模型，通過連續(xù)鞘內(nèi)注射AGM結合行為學檢測，結果顯示，建模后12天，B 、 C組大鼠機械縮足反射閾值均明顯低于A組，C 組機械縮足反射閾值高于B組(P<0.05)，證明AGM可有效緩解骨癌痛大鼠的痛覺過敏，但其疼痛治療的作用機制尚不清楚。

骨癌痛發(fā)生機制十分復雜[12]，目前公認的骨癌痛發(fā)病機制包括局部缺血缺氧微環(huán)境改變、各種細胞因子高表達導致膠質細胞的活化以及突觸重塑導致的中樞敏化等。事實上這些機制可能存在相互協(xié)同作用，在骨癌痛的發(fā)生和維持中意義重大。

趨化因子CXCL13 作為重要的細胞因子，在疼痛中發(fā)揮的重要作用逐漸受到學者關注。研究[13-14]證實，脊髓CXCL13通過激活小膠質細胞參與大鼠骨癌痛的形成與維持，CXCL13的活化是調控大鼠痛覺過敏的關鍵環(huán)節(jié)[15]；神經(jīng)病理性痛模型實驗中發(fā)現(xiàn)脊髓中趨化因子基因上調，尤其是CXCL13，其基因上調幅度最大[16]。本研究通過檢測CXCL13在脊髓背角神經(jīng)元上表達，定量分析顯示，建模后12天，與A組比較，B、C組大鼠CXCL13 蛋白及mRNA表達明顯增加(P<0.05)。提示上調神經(jīng)元中CXCL13表達促進了骨癌痛的形成過程，其機制可能與神經(jīng)病理性疼痛相同，與CXCL13激活脊髓背角膠質細胞有關，說明神經(jīng)元和膠質細胞之間的相互作用在疼痛形成過程中有重要意義。本實驗中通過鞘內(nèi)置管給藥，連續(xù)鞘內(nèi)注射AGM后發(fā)現(xiàn)，與B組比較, C組大鼠脊髓CXCL13 蛋白及其mRNA表達減低(P<0.05)，說明AGM可通過抑制CXCL13表達而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用可能與CXCL13調控角質細胞活性有關。

綜上所述，AGM鞘內(nèi)注射可緩解骨癌痛大鼠的痛覺過敏，其機制可能為抑制骨癌痛大鼠脊髓神經(jīng)元中CXCL13表達，抑制中樞敏化形成，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。但AGM是否直接作用于膠質細胞而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用并不清楚。另外，AGM應用的副作用以及是否對腫瘤本身產(chǎn)生作用也有待進一步深入研究。