李菲，魏日胞,2*

1南開大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，天津 300071；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心腎臟病科/全軍腎臟病研究所/腎臟疾病國家重點實驗室/國家慢性腎病臨床醫(yī)學研究中心/腎臟疾病研究北京市重點實驗室，北京 100853

截至2017年，全球共有6.97億慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者，影響約10%的人群，死亡率較高，其中近1/3的CKD患者在中國及印度，患病人數(shù)分別為1.32億和1.15億[1]。CKD 1－5期未透析患者的貧血總患病率為51.5%，CKD 5期患者的貧血總患病率甚至高達90.2%[2]，因此深入研究腎性貧血的機制具有重要意義。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種不可缺少的內(nèi)源性糖蛋白激素，在成人主要由腎臟產(chǎn)生，隨著CKD進展，EPO含量下降。腎促紅細胞生成素產(chǎn)生細胞(erythropoietin-producing cells，REPs)本質(zhì)為腎間質(zhì)成纖維細胞，以產(chǎn)生EPO為主，REPs的功能障礙及向肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化在嚙齒類動物腎損傷模型中雖已有報道[3]，但有關(guān)REPs的許多方面仍有待闡明。本文基于REPs的病理生理學研究進展，深入探討REPs與腎性貧血及腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)的關(guān)系，并以此為基礎(chǔ)總結(jié)了有關(guān)REPs轉(zhuǎn)化機制的中藥研究現(xiàn)狀。

1 REPs概述

1.1REPs簡介 REPs是隨著轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)而被發(fā)現(xiàn)的。在缺氧的微環(huán)境中，能產(chǎn)生EPO的細胞被稱為REPs。研究者分別在1993年、2008年采用原位雜交和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)證實了REPs是腎臟近髓皮質(zhì)處的間質(zhì)成纖維細胞[4-5]，且在2011年發(fā)現(xiàn)這些細胞表達成纖維細胞標志物CD73及血小板源性生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor alphapositive，PDGFR-β)[3]，隨后又有研究采用綠色熒光蛋白互補DNA(cDNA)導入內(nèi)源性EPO位點，進一步佐證了之前的觀點，此外還發(fā)現(xiàn)這些細胞具有神經(jīng)元樣形態(tài)，并表達神經(jīng)元標記基因[6]。譜系追蹤研究表明，REPs起源于腎外部位(遷移的神經(jīng)嵴細胞)，在腎發(fā)生過程中進入鼠胚腎[3]，而最近的研究發(fā)現(xiàn)了REPs的祖細胞，即具有EPO產(chǎn)生能力的細胞，衍生于表達人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框1 (human forkhead box D1，F(xiàn)OXD1) 的基質(zhì)祖細胞(其在腎臟發(fā)育過程中產(chǎn)生腎間質(zhì)成纖維細胞、周細胞、系膜細胞及血管平滑肌細胞)[7]。以上研究明確證實了REPs位于近髓皮質(zhì)處，本質(zhì)為腎間質(zhì)成纖維細胞，存在神經(jīng)元標記物的表達可能因為它起源于神經(jīng)嵴細胞。

1.2REPs調(diào)控 EPO生成不足是腎性貧血最主要的因素，其中氧感知障礙可能是CKD患者REPs生成EPO減少的機制之一[8]。在正常生理條件下，REPs在近髓皮質(zhì)處，但在氧分壓下降時，該REPs細胞群擴展至表層的皮質(zhì)間質(zhì)纖維細胞[9]，誘導EPO表達，且REPs延長其突起將毛細血管固定在小管間質(zhì)中，為EPO分泌到血液中提供了微環(huán)境結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。此外，被REPs包圍固定的毛細血管攜帶的血液已通過腎小球濾過，因此，REPs周圍的氧供持續(xù)處于低水平，從而源源不斷地產(chǎn)生EPO。除氧供減少外，REPs細胞旁的腎小管細胞消耗高水平的氧以供其重吸收(圖1)。REPs微環(huán)境中氧通量的快速變化使REPs對機體缺氧高度敏感。因此，低氧可誘導腎臟中的REPs合成EPO[10]。

機體與缺氧有關(guān)的生理及病理過程通常由低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)調(diào)節(jié)[11-12]。 在基因轉(zhuǎn)錄水平上，全身性基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，HIF特異性脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase domain proteins，PHD)2及HIF2α是調(diào)控REPs中EPO基因表達最重要的因子[13-14]。REPs細胞在常氧狀態(tài)處于靜止期，且大多數(shù)REPs在健康小鼠中不產(chǎn)生EPO[15]，為REPs的儲存庫(OFF-REPs)。當氧分壓降低時，OFF-REPs通過PHD2-HIF2α-EPO信號軸產(chǎn)生EPO，轉(zhuǎn)為ON-REPs，致使腎臟總EPO合成明顯增加，并刺激骨髓及脾臟生成紅細胞，重新建立氧穩(wěn)態(tài)[16](圖1)。然而，即使在重度慢性貧血條件下，仍僅有10%的REPs激活為ON-REPs[17]，提示每個REPs產(chǎn)生EPO的能力很強，大多數(shù)OFF-REPs可能為更加嚴重的貧血起到儲備作用。這些數(shù)據(jù)表明缺氧是REPs活化的開關(guān)，PHD2-HIF2α-EPO信號軸功能障礙是造成腎性貧血的主要原因。

2 REPs的轉(zhuǎn)化

2.1REPs與RIF 在慢性腎病中，除腎性貧血外，RIF也是CKD的常見并發(fā)癥之一，影響著全球10%的人口，70歲以上的老年人甚至達到50%[18]。RIF的基本特征為腎肌成纖維細胞活化與增殖，細胞外基質(zhì)大量合成且降解減少，累積到腎小管周圍間質(zhì)中，最終導致腎衰竭[19]。RIF中肌成纖維細胞的來源多種多樣，主要包括骨髓來源的成纖維細胞、腎小管上皮細胞、內(nèi)皮細胞、周細胞及間質(zhì)成纖維細胞，但其確切起源仍存在廣泛爭議[20]。如前所述，分布在近髓皮質(zhì)的REPs是EPO產(chǎn)生的部位，而大量研究表明，REPs在腎臟損傷時轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞-腎促紅細胞生成素產(chǎn)生細胞(myofibroblasts-renal erythropoietin-producing cells，MF-REPs)，并導致了RIF[3,21-23]。譜系追蹤研究顯示，在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型中，遺傳性超級貧血轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟近髓皮質(zhì)處的間質(zhì)主要被MF-REPs取代，證實REPs是肌成纖維細胞的主要來源。在單側(cè)輸尿管梗阻24 h內(nèi)，REPs喪失產(chǎn)生EPO的能力，在梗阻2 d后，REPs細胞中可觀察到α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的強表達(α-SMA是肌成纖維細胞中的一種特異性標志物)。此外，通過基因分析發(fā)現(xiàn)，MF-REPs可產(chǎn)生炎性細胞因子、趨化因子及細胞外基質(zhì)，均可促進腎纖維化[23]。REPs轉(zhuǎn)化為MF-REPs后，基本喪失了產(chǎn)生EPO的能力[24]。本課題組亦發(fā)現(xiàn)嚴重的腎小管間質(zhì)損傷與腎性貧血有關(guān)[25]。因此，CKD貧血與纖維化密切相關(guān)。REPs負責CKD的兩個表型:貧血及纖維化。這種直接聯(lián)系提示我們或許可以通過靶向調(diào)節(jié)REPs的細胞特性來同時治療CKD的纖維化及貧血。

圖1 慢性腎病REPs的調(diào)控及轉(zhuǎn)化機制Fig.1 Regulation and transformation mechanism of REPs

2.2REPs的轉(zhuǎn)化及逆轉(zhuǎn)機制 近些年來，關(guān)于REPs轉(zhuǎn)化為MF-REPs的研究取得了顯著的進展，且此過程具有可逆性，為治療CKD纖維化和貧血開辟了新的途徑。Souma等[23]發(fā)現(xiàn)UUO誘導的炎癥微環(huán)境激活了REPs中的NF-κB及TGF-β Smad信號通路，從而抑制了REPs產(chǎn)生EPO，導致其向MF-REPs轉(zhuǎn)化；且NF-κB信號通路負責早期迅速抑制REPs產(chǎn)生EPO，而Smad信號通路則主要負責纖維化的激活。另外，通過逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境，恢復了REPs的能力，并且抗感染治療加速了這種表型的逆轉(zhuǎn)。López-Hernández等[26]發(fā)現(xiàn)，TNF-α參與了炎性細胞的浸潤及活化，激活NF-κB，促使成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。最近Sato等[27]建立了REPs來源的永生化可培養(yǎng)細胞系(Replic細胞系)，證實了TGF-β信號轉(zhuǎn)導途徑有助于維持Replic細胞系的肌成纖維細胞特征，再一次表明此通路參與了REPs的轉(zhuǎn)化。通過藥物阻斷NF-κB和TGF-β Smad信號通路，或許可以逆轉(zhuǎn)REPs的轉(zhuǎn)化，靶向治療CKD的貧血及纖維化。

最近對REPs的表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)成纖維細胞的激活及其向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化受到了表觀遺傳機制的調(diào)控[28]。Bechtel等[29]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1引起的RASAL1啟動子甲基化可導致成纖維細胞活化以及持續(xù)的腎臟纖維化，此過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介導。隨后Tampe等[30]再一次證實了此觀點。此外，Chang等[8]發(fā)現(xiàn)DNMT1抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza)通過抑制EPO基因啟動子的DNA甲基化，恢復了原代培養(yǎng)小鼠MF-REPs產(chǎn)生EPO的功能，提示Aza在一定程度上可恢復REPs的功能。然而使用Aza會產(chǎn)生多種不良反應，高劑量的Aza可能因其細胞毒性而誘導骨髓抑制，因此仍需大量實驗進一步評估其功效。

Sato等[31]認為REPs的轉(zhuǎn)化分為2個階段，即PHD過度活化的早期MF-REPs階段及EPO啟動子高甲基化的進行性MF-REPs階段，因此PHD抑制劑可有效抑制早期MF-REPs。但矛盾的是，Souma等[24]發(fā)現(xiàn)，PHD的敲除重新激活了MF-REPs中EPO基因的表達，但對腎臟的病理性纖維化無保護作用，猜測可能的原因是早期MF-REPs基本不參與腎臟纖維化的進程，但仍需要進一步探究。

3 有關(guān)REPs轉(zhuǎn)化機制的中藥研究現(xiàn)狀

3.1抑制TGF-β Smad信號通路

3.1.1純化合物 茯苓酸(一種茯苓菌核成分)可通過阻斷Smad2/3-TGF-β受體蛋白的相互作用，抑制TGF-β1/Smad通路[32]。丹酚酸A、B及丹參酮ⅡA(丹參成分)均可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來抑制腎纖維化并改善腎功能[33-35]。鹽酸川芎嗪可明顯降低UUO大鼠TGF-β1mRNA的表達[36]。雙氫青蒿素可通過調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖及分化治療腎臟纖維化，且可明顯減弱TGF-β1誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[37]。3,3'-二吲哚甲烷(十字花科植物中提取的一種天然酸縮合物)可通過抑制成纖維細胞活化及TGF-β/Smad 2/3信號通路減輕RIF[38]。

3.1.2中草藥復方 黃芪湯(由黃芪、茯苓、天花粉、麥冬、五味子、甘草、生地組成)可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路逆轉(zhuǎn)5/6腎切除大鼠的腎纖維化，考慮與抑制成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞有關(guān)[39]?？估w靈顆粒(由丹參、大黃、當歸、牛膝、桃仁組成)可抑制成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[40]。此外，尿毒清顆粒[41]可抑制UUO小鼠模型的TGF-β1信號通路。

3.2抑制NF-κB信號通路

3.2.1純化合物 丹參酮ⅡA也可通過抑制NF-κB通路來減輕腎纖維化及炎癥[35]。黃芪甲苷(膜夾黃芪生物活性成分)可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的活性抑制成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及細胞外基質(zhì)的形成[42]。紅景天苷(玫瑰紅景天的活性成分)可明顯減少炎性因子的釋放，并抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而改善RIF[43]。

3.2.2中草藥復方 雷公藤總甙片可通過抑制TLR4/NF-κB通路改善腎纖維化[44]。六味地黃丸可通過抑制氧化應激，脂質(zhì)過氧化，TGF-β/Smad、MAPK及NF-κB信號通路預防腎纖維化[45]?？估w靈顆粒也可通過抑制NF-κB信號通路預防腎臟纖維化[36]。

3.3干預DNA甲基化 姜黃素(姜黃中提取的多酚類色素)可抑制Klotho(一種抗衰老和纖維化抑制蛋白)啟動子的CpG甲基化，從而抑制TGF-β途徑、減輕腎纖維化[46]。金雀異黃素(染料木素)通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶，恢復Klotho表達，進而發(fā)揮抗纖維化作用[47]。上述中藥可能通過恢復Klotho表達，進而抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導途徑，最終抑制REPs向MF-REPs的轉(zhuǎn)化，從而達到治療的目的?？傊深ADNA甲基化為治療CKD帶來了新的曙光。

綜上所述，本文對REPs與CKD貧血及纖維化的關(guān)系進行綜述，闡明了REPs向MF-REPs的轉(zhuǎn)化是CKD發(fā)生貧血及纖維化的重要原因，而恢復纖維化腎臟REPs的生理特征將為治療CKD開辟新的途徑。許多中藥可明顯抑制REPs的轉(zhuǎn)化，但遺憾的是以上研究均側(cè)重的是抗腎纖維化，是否對腎性貧血有改善作用仍需科研工作者的深入研究，且更多中藥的抗REPs轉(zhuǎn)化機制也需不斷探索。