蘇炳燭 簡功輝 謝青玲 唐曉璐 楊卓 向黎黎 陸小龍 熊輝

〔摘要〕 目的 研究膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）肝腎虧虛證與寒濕痹阻證的差異代謝物，探討KOA肝腎虧虛證與寒濕痹阻證辨證差異的物質(zhì)代謝輪廓。方法 選取KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者各30例，采用核磁共振氫譜（1H nuclear magneticresonance spectroscopy，1H-NMR）技術測定血漿中的小分子代謝物，采用主成分分析法和正交偏最小二乘法-判別分析，進行多元統(tǒng)計分析。結(jié)果 肝腎虧虛組與寒濕痹阻組血漿樣本有5個差異代謝物有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中高密度脂蛋白、檸檬酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白在肝腎虧虛組患者中含量明顯高于寒濕痹阻組患者，而醋酸、組氨酸含量明顯低于寒濕痹阻組患者。依富集程度（P<0.05）判別代謝通路為乙醛酸和二羥酸代謝、組氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)、β-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生。結(jié)論 KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者存在差異代謝物，分型的差異代謝物質(zhì)基礎可能是檸檬酸鹽、組氨酸和醋酸。其中醋酸、組氨酸可能為寒濕痹阻證的標志性代謝產(chǎn)物。

〔關鍵詞〕 膝骨關節(jié)炎;肝腎虧虛;寒濕痹阻;核磁共振氫譜;代謝組學

〔中圖分類號〕R274.9;R684.3 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.021

〔Abstract〕 Objective To study the difference of metabolites between liver-kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome in knee osteoarthritis （KOA）， and to explore the material metabolism profile of the difference between liver-kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome in KOA. Methods The plasma of 30 KOA patients with liver and kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome were collected. 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy （1H-NMR） technology was applied to determine small molecule metabolites in plasma. Principal component analysis and partial least squares discrimination analysis were performed to conduct multivariate statistical analysis. Results There were 5 different metabolites in the plasma samples of liver and kidney deficiency group and cold-dampness Bi group， with statistical significance （P<0.05）. The contents of high density lipoprotein （HDL）， citrate and low density lipoprotein （LDL）/very low density lipoprotein （VLDL） in patients with liver-kidney deficiency group were significantly higher than those in patients with cold-dampness Bi group， while the contents of acetate and histidine were significantly lower than those in patients with cold-dampness Bi group. According to the enrichment degree （P<0.05）， the metabolic pathway was identified as glyoxylate and dicarboxylate metabolism， histidine metabolism， citrate cycle， β-alanine， pyruvate metabolism， glycolysis/gluconeogenesis. Conclusion There are different metabolites in KOA patients with liver and kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome. Citrate， histidine and acetate may be the different metabolites of syndrome type. Acetate and histidine may be the iconic metabolites of cold-dampness Bi syndrome.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; deficiency of liver and kidney; cold-dampness Bi syndrome; 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy; metabolomics

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是發(fā)生在膝關節(jié)的髕股關節(jié)或內(nèi)外側(cè)間室的骨性關節(jié)炎，由于膝關節(jié)軟骨退行性改變，導致軟骨磨損、破壞，伴有關節(jié)周圍骨質(zhì)增生，是一種以軟骨損傷為主的慢性、退行性關節(jié)病[1-2]。KOA在中老年人中的發(fā)病率較高[3]，中醫(yī)學將其歸屬于“痹證”范疇[4]。“證”是中醫(yī)辨證論治的起點與核心，證本質(zhì)研究具有實際的臨床價值[5]。代謝組學可作為中醫(yī)證候研究的一種技術手段[6]。本研究采用核磁共振氫譜（1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）檢測技術分析KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者血漿的代謝產(chǎn)物，尋找KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證的代謝差異物，為“證”的本質(zhì)差異研究提供物質(zhì)基礎。

1 對象

1.1 ?一般資料

選取2019年1月至2019年12月就診于湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院的KOA患者，年齡在50～74歲的KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者各30例，其中每組男15例，女15例;肝腎虧虛組，年齡（62.3±8.6）歲，病程（3.4±2.9）年。寒濕痹阻組，年齡（62.2±7.5）歲，病程（3.6±3.3）年。兩組患者性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 ?診斷標準

參照膝骨關節(jié)炎中西醫(yī)結(jié)合診療指南中的診斷標準[7]：（1）近1個月內(nèi)反復膝關節(jié)疼痛;（2）晨僵≤30 min;（3）活動時有骨擦音（感）;（4）中老年患者（≥50歲）;（5）X線檢查（站立或負重位）示關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和（或）囊性變、關節(jié)緣骨贅形成;（6）MRI示軟骨損傷、骨贅形成、軟骨下骨骨髓水腫和（或）囊性變、半月板退行性撕裂、軟骨部分或全層缺失。滿足診斷標準（1）+（2）+（3）+（4）或（1）+（5）或（1）+（6）條，診斷為KOA。

1.3 ?中醫(yī)證候診斷

參照《膝骨關節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識（2015年版）》[4]《膝骨關節(jié)炎中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[7]中的證候診斷。（1）寒濕痹阻證 ①主癥：關節(jié)疼痛重著、遇冷加劇、得溫則減。②次癥：腰身重痛。③舌象與脈象：舌質(zhì)淡，苔白膩，脈沉。（2）肝腎虧虛證 ?①主癥：關節(jié)隱隱作痛。②次癥：腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚。③舌象與脈象：舌質(zhì)紅，少苔，脈沉細無力。

1.4 ?納入標準

（1）符合上述診斷標準;（2）符合依據(jù)“探脈哥智能中醫(yī)輔助診療系統(tǒng)（登記號：2020SR0117189）”和上述診療方案的診療標準進行計算機評判后確定的中醫(yī)證型標準;（3）近1個月內(nèi)未曾服用過非甾體抗炎藥、激素等藥物或接受其他治療者;（4）受試者自愿加入本研究方案，并簽署知情同意書。

1.5 ?排除標準

（1）合并類風濕關節(jié)炎、色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎、滑膜結(jié)核、滑膜軟骨瘤病、痛風性關節(jié)炎、創(chuàng)傷性滑膜炎等其他關節(jié)疾病患者;（2）合并有嚴重的肺、肝、腎、心腦血管、血液性、代謝性及精神類疾病患者;（3）病人有關節(jié)創(chuàng)傷史;（4）接受過激素治療或膝關節(jié)局部有破潰、感染、化膿者;（5）孕婦或哺乳期婦女。

2 方法

2.1 ?樣本采集與前處理

患者禁食、禁水12 h以上，采集靜脈血，加入枸櫞酸鈉抗凝劑，離心分離出血漿，離心后將血液封存于EP管中，并標記分組信息及編號。置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

將預處理后的血漿樣本從-80 ℃冰箱中取出，室溫放置，待其融化后，取200 μL上層清液于離心管中，加入400 μL用重水配制的0.9%氯化鈉溶液（含0.3 mg/mL TSP），渦旋混勻，以13 000 r/min在4 ℃的低溫離心機中離心10 min，離心完成后取上層清液550 μL，加入編號的5 mm核磁管中，并將其放入4 ℃冰箱，于24 h內(nèi)進行NMR檢測。

2.2 ?NMR采集

血漿樣本的1H-NMR譜圖采集在Bruker AVANCE Ⅲ 600 MHz超導核磁共振波譜儀上進行，為了測定血漿中的小分子代謝物，采用弛豫編輯（Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG）脈沖序列對樣品進行測定，實驗參數(shù)如下：譜寬20.0 ppm，采集點數(shù)64 K，弛豫延遲2 s，累加次數(shù)128次，90°脈沖寬度12 μs，采集時間1.36 s。所有實驗均在5 mm多核寬帶觀測（BBO）的探頭上進行，測試溫度維持在298 K。采用Topspin 3.5軟件對采集的原始譜圖進行傅立葉變換以及基線校正、相位調(diào)整，并將TSP作為化學位移的參考峰，定為0 δ ppm。使用MestReNova 12.0 軟件對核磁譜圖進行處理，將0.5～9.5 ppm 區(qū)域內(nèi)譜圖以0.004 ppm為單位進行分段積分，并去除4.77～5.20 ppm區(qū)域殘余水峰信號。所得積分值按每張圖譜的總積分面積進行歸一化處理，數(shù)據(jù)最終在Excel 2010軟件上以CSV格式保存。

2.3 ?數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA-P 14.1軟件（Umetrics AB， Umea， Sweden）對歸一化后的數(shù)據(jù)進行多元數(shù)據(jù)分析。為了從總體上反映兩組樣本之間的代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度的大小，對數(shù)據(jù)采用中心化換算的數(shù)據(jù)標準化方式預處理之后，進行主成分分析（principal component analysis， PCA）。此外，為了消除個體差異、年齡、性別等相關因素對分組的影響，強化組間差異，確定差異代謝物，對數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），并將OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值>1.0作為差異代謝物篩選的重要標準之一。

3 結(jié)果與分析

3.1 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本的PCA、OPLS-DA分析

兩組血漿樣本PCA分析共獲得個7主成分，累積R2X=0.482，Q2=0.137，PCA得分圖結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示：模型中的主成分積分值集中分布于散點圖（95%的置信區(qū)域內(nèi)）的4個區(qū)域中，說明肝腎虧虛組與寒濕痹阻組患者中的代謝物存在差異。兩組樣本OPLS-DA分析模型（R2X=0.31，R2Y=0.966，Q2=0.197）得分圖如圖2所示。結(jié)果顯示：兩組樣品在t[1]維較好地分開，說明組間差異有統(tǒng)計學意義。

3.2 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本OPLS-DA的相關系數(shù)負載

肝腎虧虛組與寒濕痹阻組血漿樣本OPLS-DA的相關系數(shù)負載圖3可以直觀看出使得兩組樣本存在的代謝物。結(jié)合OPLS-DA模型對潛在生物標志物進行篩選鑒定，最終得到5個差異代謝物（P<0.05），其結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明：高密度脂蛋白、檸檬酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、組氨酸在肝腎虧虛組患者中含量明顯高于寒濕痹阻組患者，而醋酸鹽含量明顯低于寒濕痹阻組患者。見圖3。

3.3 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本中差異物質(zhì)通路歸屬

通路分析采用MetaboAnalyst v.2.0（www.metaboanalyst.ca）進行，以富集程度（P<0.05，P值越低表明富集程度越高）判別代謝通路其結(jié)果如表2所示。最終發(fā)現(xiàn)肝腎虧虛組與寒濕痹阻組主要差別（P<0.05）在于乙醛酸和二羥酸代謝、組氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、β-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生。

4 討論

“證”是對疾病發(fā)展過程中某一階段病機特點的整體概括，“證”具有“階段性”和“非特異性”[8]。代謝組學從微觀上，研究機體代謝進程中所有代謝物的變化規(guī)律[9]。二者的思路和方法都是研究機體的特定“狀態(tài)”，表現(xiàn)為體液中內(nèi)源性成分的變化，并以組、群、譜的特征出現(xiàn)[10]。KOA病理主要與軟骨代謝相關，涉及到其他組織如滑膜[11]、韌帶以及軟骨下骨的變化[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組血清樣本代謝物存在差異，有統(tǒng)計學意義。

4.1 ?相關代謝物參與的KOA發(fā)病機制之間的關聯(lián)性推斷

高密度脂蛋白（HDL）升高可見于KOA患者，絕經(jīng)后女性KOA骨量[12]與HDL呈正相關，可能是引起軟骨下骨改變的原因。羅緒林等[13]應用針刀結(jié)合手法干預KOA病人發(fā)現(xiàn)其機制可能是通過干預的脂質(zhì)和HDL代謝來達到治療作用。

低密度脂蛋白（LDL）是由極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)變而來，LDL被氧化能夠促進軟骨骨贅形成、促進炎癥反應及加速軟骨細胞凋亡[14]。LDL被氧化修飾而成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，在關節(jié)軟骨的退變中起到核心的促進作用，是KOA病情診斷的標志物之一[15]。

醋酸，是一種有機一元酸，典型的脂肪酸。有研究表明應用關節(jié)腔注射碘乙酸可建立大鼠骨關節(jié)炎模型，并且隨著劑量的加大關節(jié)損傷越嚴重[16]。乙酸可致小鼠疼痛出現(xiàn)扭體反應，已成為常規(guī)鎮(zhèn)痛藥物篩選方法。

檸檬酸是脂肪、蛋白質(zhì)及糖三大能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化的核心環(huán)節(jié)，是有氧代謝過程的中心代謝途徑，是機體獲得能量的主要方式，其可能與關節(jié)軟骨及導致線粒體功能障礙相關[17]。

組氨酸能在組氨酸脫羧酶的作用下脫羧形成組胺，組胺具有很強的血管舒張作用，并與多種變態(tài)反應及炎癥有關[18]。組氨酸與氧化損傷有關，是活性氧自由基的直接清除劑，降低關節(jié)內(nèi)氧自由基的水平，可減輕關節(jié)軟骨的損傷[19-20]。

根據(jù)差異代謝產(chǎn)物與主要代謝通路間關系，組氨酸主要參與了β-丙氨酸、組氨酸代謝。醋酸主要參與了丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、糖酵解和糖異生。檸檬酸主要參與了TCA循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝。6條通路主要與3個代謝產(chǎn)物相關，在機體能量代謝過程中發(fā)揮重要作用。

4.2 ?差異代謝物參與的KOA證型之間的關聯(lián)性推斷

虛實是辨別人體正氣強弱和病邪盛衰的兩個綱領。實證主要取決于邪盛方面，而虛證主要取決于正虛方面。肝腎虧虛證屬虛癥，寒濕痹阻證屬實證。二者差異代謝物及代謝通路提示能量代謝的差異。肝腎虧虛證處于相對能量不足狀態(tài)，可導致氣血運行不足，這與肝腎虧虛證患者常伴有腰膝酸軟乏力等有關。

檸檬酸多與能量相關。在肝腎虧虛證患者中含量明顯高于寒濕痹阻證患者，其代謝差異可能是由于不能被中心體充分利用，進而導致代謝物堆積。差異代謝物在肝腎虧虛證患者中明顯增多，提示可能由于其證候本身的虛實所導致。

實證疼痛多劇烈，乙酸致小鼠扭體反應模型可以模擬腹腔炎癥引起的腹痛癥狀，其在寒濕痹阻組較高。與寒濕痹阻證和肝腎虧虛的臨床疼痛癥狀差異相符合。應用細辛提取物可顯著降低乙酸導致小鼠扭體的扭體次數(shù)[21]。細辛性味辛溫，有散寒功效，熱藥治寒提示醋酸可能為寒濕痹阻證的標志性代謝產(chǎn)物。骨內(nèi)高壓與骨內(nèi)血流動力學異常有關，可致KOA的發(fā)生[22]?？蒲兄谐Ｓ媒Y(jié)扎供給血管造模[17]。溫熱方藥能改善因寒邪導致的器官血流動力學異常，增加其血液灌注[23]。組氨酸與血管收縮相關，本次研究提示其在寒濕痹阻證患者較高，推測其可能為寒濕痹阻證的特異性代謝產(chǎn)物。

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