藺美娜，盧永平，陳薪任，趙寧，隋鈺，姜淼

（國(guó)家衛(wèi)健委生殖健康與遺傳醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬生殖醫(yī)院優(yōu)先遺傳科，沈陽(yáng) 110031）

眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism，OCA）是一組以眼、皮膚、毛發(fā)黑色素沉著減少或缺乏為主要臨床表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳病，全世界發(fā)病率約為1/20 000，中國(guó)漢族人口中發(fā)病率為1/18 000。OCA一般是由黑色素合成或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因突變所引起的，主要臨床表現(xiàn)為普遍色素沉著不足，眼部改變包括黃斑中心凹發(fā)育不良、屈光不正、視力低下、畏光、虹膜半透明、眼球震顫、眼底著色不足及視覺(jué)纖維通路異常等。目前發(fā)現(xiàn)至少20個(gè)基因與OCA有關(guān)，其中包括7個(gè)非綜合征OCA基因和13個(gè)綜合征OCA基因，7個(gè)非綜合征OCA基因分別是導(dǎo)致OCA1（OMIM#203100，#606952）、OCA2（OMIM#203200）、OCA3（OMIM#203290）、OCA4（OMIM #606574）、OCA5（OMIM #615312 ）、OCA6（OMIM #113750）、OCA7（OMIM#615179）的TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2、OCA5、SLC24A5和C10orf11［1］，13個(gè)綜合征OCA基因分別為HPS1、AP3B1、HPS3、HPS4、HPS5、HPS6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6、LYST、MYO5A、SMS、BEHRS。OCA分型比較多，癥狀相似，單純通過(guò)臨床表型很難區(qū)分，一般通過(guò)分子遺傳學(xué)診斷確定分型。本研究報(bào)道了一個(gè)父子兩代發(fā)病的OCA家系，通過(guò)全外顯子測(cè)序技術(shù)識(shí)別致病基因并確定分型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者，男，42歲，表現(xiàn)為臉部皮膚白色，虹膜半透明，頭發(fā)顏色略淺，眉毛黃白色，睫毛白色，視力差，高度近視，眼球左右震顫，畏光，智力正常。其妻子無(wú)癥狀，腿部殘疾，智力正常。其子10歲，具有與先證者同樣的臨床表現(xiàn)，包括虹膜半透明、皮膚白色、眼球震顫、視力差等，家系圖見(jiàn)圖1。本研究經(jīng)遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有基因診斷工作均獲得患者家屬的同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

圖1 眼皮膚白化病家系圖

1.2.1 標(biāo)本收集和DNA提取：采集家系所有成員的靜脈血5 mL，EDTA抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用核酸自?dòng)提取儀QIAcube提取家系成員血液基因組DNA，試劑盒為QIAamp DNA Blood Mini Kit（貨號(hào)51106，德國(guó)Qiagene公司），使用NanoDrop1000紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）和Qubit3.0（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定DNA濃度，-20 ℃凍存，待測(cè)序。

1.2.2 全外顯子測(cè)序：先證者血液基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)化，取50 ng先證者血液DNA，根據(jù)Sure Select Target Enrichment System 目標(biāo)序列富集試劑盒（美國(guó)Agilent公司）的說(shuō)明書進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，依次經(jīng)過(guò)純化、捕獲、加接頭、標(biāo)記等程序，最后使用Agilent Bioanalyzer 2100（美國(guó)Agilent公司）對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，然后取文庫(kù)20 pmol上機(jī)測(cè)序，測(cè)序儀為NEXTSEQ 500（美國(guó)illumina公司）。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)bcl2fastq v2.18由bcl格式轉(zhuǎn)換為fastq格式，通過(guò)BWA（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）與GRCh37/hg19參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)GATK4（https：//software.broadinstitute.org/gatk/）收集變異信息，通過(guò)Annovar（http：//annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）進(jìn)行注釋。

1.2.3 Sanger測(cè)序：根據(jù)UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）報(bào)道的TYR基因序列（NM_000372.4），使用Primer5.0設(shè)計(jì)TYR基因所有外顯子及接頭序列的PCR引物（表1）；由上海生工生物公司合成，PCR試劑為2 X goldstarMix（北京康為世紀(jì)），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與TYR基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子測(cè)序結(jié)果

全外顯子測(cè)序目標(biāo)捕獲區(qū)平均測(cè)序深度為60 X，堿基質(zhì)量值≥30（Q30）的比例為80%，TargetEnrichment System 試劑盒共檢測(cè)4 000個(gè)基因，檢出可能致病的突變136個(gè)，選取與白化病相關(guān)的基因優(yōu)先分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者存在TYR c.1A＞G純合突變。此位點(diǎn)在1 000 Genome Project數(shù)據(jù)庫(kù)和EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有記錄，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件MutationTaster和SIFT進(jìn)行預(yù)測(cè)，提示此位點(diǎn)可能為致病位點(diǎn)。

表1 TYR基因PCR引物序列

2.2 Sanger測(cè)序結(jié)果

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序，結(jié)果顯示先證者存在TYRc.1A＞G純合突變；先證者的兒子存在TYRc.1A＞G和TYRc.929-930insC復(fù)合雜合突變；先證者妻子攜帶TYRc.929-930insC雜合突變，見(jiàn)圖2。

圖2 眼皮膚白化病家系成員Sanger測(cè)序圖

3 討論

OCA1是最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的非綜合征型眼皮膚白化病，發(fā)病率為1 ∶40 000，OCA1約占全世界白化病病例的50%。OCA1在不同人群中具有不同的發(fā)病率，高加索人群中最常見(jiàn)，中國(guó)人群中OCA1病例為白化病患者的64.3%～70.1%，非裔美國(guó)人中很少見(jiàn)。OCA1主要是由于TYR基因突變導(dǎo)致的，根據(jù)突變后殘基的活性和黑色素合成情況可以分成OCA1A和OCA1B 2個(gè)亞型。OCA1A表型最嚴(yán)重，由于TYR基因無(wú)效突變產(chǎn)生不完整的多肽，終生幾乎檢測(cè)不到酪氨酸酶活性和黑色素合成，表現(xiàn)為白色頭發(fā)和睫毛、乳白色的皮膚、淡藍(lán)色或者半透明的虹膜；OCA1B癥狀較輕，由于TYR基因突變導(dǎo)致酪氨酸酶活性降低，可以部分檢測(cè)到酪氨酸酶活性和黑色素合成，圍產(chǎn)期出現(xiàn)臨床癥狀，隨著年齡的增長(zhǎng)可能改善［2］。2種類型的OCA1都會(huì)出現(xiàn)視力低下、中央凹發(fā)育不全、眼球震顫等癥狀。根據(jù)HGMD專業(yè)版2018.3（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=TYR）大約有445個(gè)TYR基因突變位點(diǎn)被報(bào)道。

TYR（OMIM 606933）基因位于染色體11q14.3，包含5個(gè)外顯子，編碼一個(gè)52×103（529個(gè)氨基酸）的具有雙重功能的Ⅰ型膜蛋白，它具有酪氨酸酶活性，催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴，并在黑色素細(xì)胞中將多巴氧化為多巴醌；同時(shí)TYR蛋白還具有二羥吲哚氧化酶的活性。因此，TYR蛋白是黑色素形成過(guò)程中的關(guān)鍵因素，TYR基因突變導(dǎo)致酪氨酸酶功能異常，黑色素部分或全部喪失，引起白化?。?］。

本研究中，先證者父子均患有OCA1，呈現(xiàn)假顯性遺傳模式，應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行致病基因識(shí)別，Sanger測(cè)序?qū)蚁党蓡T進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，先證者是TYRc.1A＞G純合突變，其妻攜帶TYRc.929-930insC雜合突變，其子存在TYRc.1A＞G和c.929-930insC復(fù)合雜合變異。由此可見(jiàn)在家族遺傳病的分析過(guò)程中，可能被假性的遺傳模式干擾，要通過(guò)進(jìn)一步的分子診斷技術(shù)正確識(shí)別致病基因。

起始密碼子變異比較罕見(jiàn)，TYRc.1A＞G雜合突變1994年首次被英國(guó)摩菲眼科醫(yī)院報(bào)道［4］，OCA患者同時(shí)合并TYRc.370T＞G和402G＞A 2個(gè)雜合突變。1989日本首次報(bào)道了TYRc.929-930insC純合突變，并且通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)此突變可以導(dǎo)致酪氨酸酶活性降低［5］。隨后在其它國(guó)家也報(bào)道了OCA1中TYRc.929-930insC雜合突變復(fù)合其它位置的雜合突變［6-7］，而且攜帶TYRc.929-930insC雜合突變的患者均表現(xiàn)為眼球震顫［8］。2014年對(duì)來(lái)自中國(guó)34個(gè)家庭的98個(gè)患者進(jìn)行篩查檢測(cè)，首次報(bào)道了TYRc.1A＞G雜合突變，同時(shí)篩查結(jié)果顯示TYRc.1A＞G和c.929_930insC的發(fā)生率為分別為1/68和6/68［8］。WANG等［9］報(bào)道TYRc.832C＞T 和TYRc.929_930insC復(fù)合雜合突變導(dǎo)致OCA1表型。目前世界上還沒(méi)有TYRc.1A＞G純合突變的報(bào)道，TYRc.929_930insC在中國(guó)人群比較高發(fā)，本次研究首次報(bào)道了TYRc.1A＞G和c.929-930insC復(fù)合雜合突變，TYRc.1A＞G導(dǎo)致TYR蛋白無(wú)法表達(dá)，TYRc.929-930insC導(dǎo)致TYR蛋白提前終止，都是致病性突變，結(jié)合患者的表型特征，該家系可能是OCA1A亞型。因此，TYRc.1A＞G純合突變和TYRc.1A＞G和c.929-930insC復(fù)合雜合突變可能與OCA1A的表型有關(guān)。