河北省貉子毛滴蟲感染情況調(diào)查及超微結(jié)構(gòu)觀察

柳 佳，梅汝蕃，李永秀，潘素敏，杜義明，陳麗鳳，史秋梅，張西臣，劉 璐，王秋悅*

(1.河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島063000；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.河北科技師范學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 063000)

毛滴蟲屬原生動(dòng)物門、動(dòng)物鞭毛蟲綱、毛滴目、毛滴蟲科、毛滴蟲屬，是一種致病性原蟲，擁有廣泛的宿主，包括人類以及非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物等[1]。大多數(shù)寄生于犬科動(dòng)物的毛滴蟲為人五毛滴蟲，是一種人獸共患原蟲，寄生在腸道內(nèi)并引起動(dòng)物腹瀉、嘔吐等癥狀。

近年來，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)在幼犬腹瀉糞便中觀察到毛滴蟲的報(bào)道[2-3]。在動(dòng)物中，尤其是毛皮動(dòng)物中，人們對(duì)毛滴蟲所造成危害的認(rèn)識(shí)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，國(guó)內(nèi)外對(duì)毛皮動(dòng)物體內(nèi)毛滴蟲的研究報(bào)道甚少[4]。河北省是毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖大省，貉子養(yǎng)殖占有重要的經(jīng)濟(jì)地位，近年來筆者發(fā)現(xiàn)由毛滴蟲感染引起毛皮動(dòng)物腹瀉的病例大量增加，但常被誤診為細(xì)菌或病毒感染，導(dǎo)致用藥不當(dāng)，延誤治療，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)滴蟲病的研究與防治工作的重要性日益突出。

我們之前的研究對(duì)貉子體內(nèi)分離出的毛滴蟲進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)其是由人體內(nèi)的毛滴蟲感染所致[4]。毛皮動(dòng)物毛滴蟲感染存在著較大人獸共患的風(fēng)險(xiǎn)，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，應(yīng)當(dāng)加以足夠的重視并進(jìn)行深入研究。為此，我們于2015年6月—2017年8月對(duì)河北省部分地區(qū)貉子毛滴蟲的感染情況做了調(diào)查統(tǒng)計(jì)，并對(duì)毛滴蟲超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。以期為河北省地區(qū)貉子養(yǎng)殖業(yè)毛滴蟲病的防治工作提供大量的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集及主要試劑取自2015年6月—2017年8月送至河北科技師范學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院的河北各地區(qū)毛皮動(dòng)物腹瀉病例680例。青霉素、硫酸鏈霉素、碘液、瑞氏染液、無水乙醇、三氯化鐵、RPMI1640培養(yǎng)基等試劑均由河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 毛滴蟲直接鏡檢法于棉簽取腹瀉貉子的糞便少量，涂抹于載玻片上，滴加1滴生理鹽水，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察，看是否有滴蟲感染并記錄下滴蟲的形態(tài)特征。

1.3 蟲體的分離與培養(yǎng)用無菌棉簽刮取適量腸黏膜物，然后將棉簽放入滅菌10 mL離心管中，在管中加入RPMI1640培養(yǎng)液8.0 mL，青鏈霉素雙抗(104U/mL)溶液1.0 mL，胎牛血清1.0 mL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36 h后傳代，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天至蟲體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，以備后用。

1.4 蟲體染色觀察取培養(yǎng)48 h的蟲液3 mL，2 500 r/min 離心5 min，取沉淀，再加入0.5 mL PBS溶液并吹吸均勻，然后吸取200 μL蟲液于載玻片上做45推片，自然晾干備用。吸取適量瑞氏染色液均勻覆蓋在待染色載玻片上，30 s后用水緩緩沖洗，常溫晾干并及時(shí)鏡檢。

1.5 蟲體體外凍存復(fù)蘇試驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的蟲體懸液轉(zhuǎn)移至5 mL EP管中。為比較已報(bào)道的兩種常用的原蟲離心條件的優(yōu)劣，將待凍存的10管蟲體分為A、B 2組，每組5管。A組離心條件設(shè)定為3 000 r/min，離心10 min。B組離心條件為2 000 r/min，離心10 min。然后加入900 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基吹吸重懸后加入100μL DMSO凍存保護(hù)劑并混勻轉(zhuǎn)移至凍存管中，液氮保存。復(fù)蘇時(shí)將凍存管取出后立即進(jìn)行37℃恒溫水浴。將融化后蟲體懸液移至新鮮37℃ 1640完全培養(yǎng)基中，分別于培養(yǎng)后第0，6，12，24，48，54，60 h觀察并記錄蟲體生長(zhǎng)情況。

1.6 蟲體超微結(jié)構(gòu)觀察將復(fù)蘇純化好的蟲體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清后沉淀用37℃ PBS重懸，2 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入1 mL 2.5%戊二醛固定液，將沉淀吹吸混勻，于4℃固定，將樣品送至電鏡室，制樣后在掃描電鏡和透射電鏡下觀察蟲體的表面、細(xì)胞核、鞭毛、盾膜、軸桿、波動(dòng)膜、過氧化氫酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7 貉子毛滴蟲感染情況統(tǒng)計(jì)分析對(duì)貉子糞便鏡檢毛滴蟲感染陽(yáng)性的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其在季節(jié)分布、性別分布、年齡分布等的差異。

2 結(jié)果

2.1 貉子臨床剖檢變化腹瀉貉子有的表現(xiàn)為食欲不振，精神萎靡，死前有不吃食現(xiàn)象，偶見伴有嘔吐現(xiàn)象，均有腹瀉癥狀，糞便顏色深淺不一，有的病例為暗綠色或黑色，有的病例為黃白色稀便。剖檢病變?yōu)橛械牟±麄€(gè)腸黏膜出血嚴(yán)重，盲腸有潰瘍；有的病例病變僅限于盲腸，盲腸腫大為普通的2倍以上。

2.2 直接鏡檢直接鏡檢法可在低倍鏡下可見大量快速游動(dòng)的蟲體，呈螺旋狀前進(jìn)或是原地做圓圈運(yùn)動(dòng)。高倍鏡下可見卵圓形或梨形半透明蟲體，部分蟲體有1～4根不等的鞭毛。

2.3 蟲體染色瑞氏染色可見蟲體呈梭形，細(xì)胞質(zhì)被染成淡藍(lán)色，細(xì)胞核被染成深紫色，核質(zhì)分界清晰，前后鞭毛清晰可見(圖1)。

圖1 毛滴蟲瑞氏染色觀察(400×) A.前鞭毛；B.獨(dú)立鞭毛

2.4 復(fù)蘇結(jié)果以DMSO做凍存保護(hù)劑對(duì)培養(yǎng)的蟲體進(jìn)行了凍存實(shí)驗(yàn)。凍存實(shí)驗(yàn)所用的蟲體在從培養(yǎng)基取出后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用1640完全培養(yǎng)基將蟲體懸液調(diào)整為1.5×106個(gè)/mL的初始密度。A組離心條件設(shè)定為3 000 r/min，離心10 min。B組離心條件為2 000 r/min，離心10 min。其他條件保持不變，凍存6個(gè)月后進(jìn)行復(fù)蘇，將復(fù)蘇后的蟲體轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后第0,6,12,24,48,54,60 h進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，根據(jù)此繪制蟲體生長(zhǎng)曲線見圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組培養(yǎng)基內(nèi)的蟲體數(shù)量明顯多于A組。因此蟲體凍存時(shí)選擇了2 000 r/min離心10 min，以備后用。

表1 蟲體復(fù)蘇結(jié)果 蟲體密度：×1000個(gè)/mL

圖2 毛滴蟲復(fù)蘇后生長(zhǎng)曲線

2.5 蟲體超微結(jié)構(gòu)觀察根據(jù)掃描電鏡的形態(tài)學(xué)觀察如圖3顯示，毛滴蟲大小為(5～10) μm×(4～8) μm,該細(xì)胞共有5根鞭毛：4根前鞭毛以及1根后鞭毛，具有獨(dú)立鞭毛的特征性形態(tài)結(jié)構(gòu)。借其前端4根鞭毛擺動(dòng)前進(jìn)，并以波動(dòng)膜波動(dòng)作螺旋式運(yùn)動(dòng)。后鞭毛從蟲體前端盾膜處發(fā)出后與波動(dòng)膜伴行，至蟲體后端游離出來。蟲體后部可見軸桿。

圖3 掃描電鏡和透射電鏡觀察蟲體 a,b,c.為掃描電鏡照片;d,e,f.為透射電鏡照片；AF.前鞭毛1-4；IF.獨(dú)立鞭毛；UM.波狀膜；P.核；AX.軸；A.高爾基體；B.細(xì)胞核；C.氫化體；D.軸桿；E.食物泡；F.前鞭毛；G.后鞭毛；H.獨(dú)立鞭毛；I.細(xì)菌

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蟲體由雙層質(zhì)膜包圍，體前1/3有1橢圓形細(xì)胞核；核膜外周可見高爾基體、氫化體、高爾基體、食物泡、軸桿。1根軸桿，纖細(xì)透明，縱貫蟲體，自后端伸出體外。體外側(cè)前1/2處，有1波動(dòng)膜，其外緣與向后延伸的后鞭毛相連。從超微結(jié)構(gòu)觀察，無完整的線粒體，此與其他原蟲有很大不同，無厭光性及嗜光性，通電偏向陰極。而且我們意外發(fā)現(xiàn)蟲體內(nèi)有腸桿菌存在(I)。

2.6 腹瀉貉子體內(nèi)毛滴蟲感染本研究共檢測(cè)680份腹瀉糞便樣本，毛滴蟲感染陽(yáng)性檢出數(shù)為364份，感染率為54%。在6-10月份毛滴蟲感染數(shù)量明顯多于其他月份(圖4)。夏秋兩季毛滴蟲感染率較高，表明毛滴蟲更適宜在溫度較高的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。養(yǎng)殖戶應(yīng)注意加強(qiáng)夏秋兩季滴蟲病的預(yù)防工作。不同性別貉子感染毛滴蟲情況見表2，其中公貉子感染率為50.8%(215/423)，母貉子感染率為58.09%(149/257),經(jīng)χ2檢驗(yàn)，不同性別貉子毛滴蟲感染率差異不顯著(P>0.05)。不同月齡貉子感染毛滴蟲情況中，2月齡以下毛滴蟲感染陽(yáng)性率為59.4%(199/335)，2月齡以上毛滴蟲陽(yáng)性率為47.8%(165/345)，2月齡以下貉子感染毛滴蟲陽(yáng)性率明顯高于2月齡以上貉子，而且患病臨床癥狀也較為明顯，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，各年齡段之間毛滴蟲感染率差異極顯著(P<0.05)。

圖4 2015年6月至2017年8月不同月份腹瀉貉子毛滴蟲感染情況

表2 貉子不同性別、年齡毛滴蟲感染情況

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于毛滴蟲的研究主要集中在致病性較強(qiáng)的陰道毛滴蟲和胚胎三毛滴蟲上，而對(duì)于常發(fā)生在犬、狐、貉等犬科動(dòng)物身上的人五毛滴蟲的研究相對(duì)較少[1,4]。過去通常認(rèn)為人五毛滴蟲是宿主腸道內(nèi)共生的原生動(dòng)物，然而近年陸續(xù)出現(xiàn)從不同宿主動(dòng)物中檢測(cè)出人五毛滴蟲的報(bào)道。比如BASTOS等[5]在慢性腹瀉病例的幼貓糞便中發(fā)現(xiàn)人五毛滴蟲的感染，LI等[6]對(duì)中國(guó)東北地區(qū)的832只綿羊和781只山羊新鮮糞便做了人五毛滴蟲的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有2只山羊糞便中感染人五毛滴蟲，LI等[7]對(duì)吉林省6種野生養(yǎng)殖動(dòng)物進(jìn)行了人五毛滴蟲的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)梅花鹿、獺兔、藍(lán)狐、銀狐、貉子、水貂的感染率分別高達(dá)20%，16.25%(13/80)，45%(27/60)，43.33%(26/60)，53.33%(32/60)和48.33%(29/60)。LI等[8]對(duì)中國(guó)北方的犬、猴子進(jìn)行了人五毛滴蟲感染的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率分別是27.38% (69/252)和46.67% (28/60)。GOOKIN等[9]在腹瀉犬中檢測(cè)到人五毛滴蟲的存在，并證實(shí)其有致病性。筆者前期通過體外分離培養(yǎng)和PCR分子鑒定首次對(duì)我國(guó)貉源毛滴蟲進(jìn)行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)其與人五毛滴蟲處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近[4]。由于人五毛滴蟲的宿主廣泛性以及人畜共患的特性，對(duì)毛滴蟲在毛皮動(dòng)物的深入研究愈發(fā)重要，尤其是明確其生物學(xué)特性及公共衛(wèi)生影響更有價(jià)值和參考意義。

河北省毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖數(shù)量巨大，貉子的發(fā)病率逐年增加，本研究結(jié)果顯示，患腹瀉病貉子普遍存在毛滴蟲感染，共檢測(cè)腹瀉貉子680只，毛滴蟲感染率高達(dá)54%(364/680)。說明河北省內(nèi)貉子滴蟲感染情況較為普遍。這可能與養(yǎng)殖戶對(duì)毛滴蟲感染缺乏了解和重視，驅(qū)蟲工作不到位、不徹底或驅(qū)蟲藥的選擇有關(guān)。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)養(yǎng)殖戶家中圈舍衛(wèi)生狀況較差，糞便不能夠及時(shí)清除或清掃的糞便和污物未能及時(shí)清理出圈舍，較長(zhǎng)時(shí)間堆放在圈舍，使得感染毛滴蟲的幾率增加。從調(diào)查結(jié)果看，毛滴蟲感染一般在6-10月份出現(xiàn)高峰，而在1-5月份和11-12月份感染數(shù)不高，說明滴蟲適宜在溫度較高的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。提醒養(yǎng)殖戶更應(yīng)注意加強(qiáng)夏秋兩季毛滴蟲病的防控。

本研究在對(duì)分離得到的蟲體進(jìn)行掃描電鏡觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，觀察到的蟲體出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，而不是光滑的，原因可能是制片過程中對(duì)切片進(jìn)行脫水的環(huán)節(jié)，切片脫水過快或前期固定不充分，導(dǎo)致蟲體出現(xiàn)皺縮。也可能是由于制片過程中用多聚賴氨酸單位數(shù)較小，導(dǎo)致活性強(qiáng)的蟲體沒有牢固固定在玻片上，但是這并不妨礙我們對(duì)毛滴蟲超微結(jié)構(gòu)的觀察，蟲體的前鞭毛和獨(dú)立鞭毛形態(tài)清晰可見。而且我們?cè)谂既坏囊淮沃破锌匆娏嗣蜗x體內(nèi)竟然有腸桿菌的存在，他們之間關(guān)系如何？是否可將細(xì)菌作為毛滴蟲的治療載體？我們將進(jìn)一步對(duì)毛滴蟲的致病機(jī)理開展深入研究，以期為毛滴蟲的治療開辟新的途徑和方法。