秦蘇佳，徐晚晴，張秋香，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

齲病是世界范圍內(nèi)最常見的兒童和成人口腔細菌性傳染病之一。其中，幼兒齲病(early childhood caries, ECC)是嬰幼兒特別是學齡前兒童患齲的一種，發(fā)展迅猛，可導(dǎo)致乳牙快速、侵襲性損壞，不僅造成牙髓疼痛，而且影響恒牙的發(fā)育和全身健康[1-2]。

牙菌斑生物膜的形成是齲病發(fā)生的先決條件[3]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是公認的主要致齲細菌，但最近研究發(fā)現(xiàn)，除了變異鏈球菌外，在患有齲齒的幼兒的牙菌斑生物膜中也經(jīng)常檢測到白色念珠菌(Candidaalbicans)[4-5]。變異鏈球菌產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTFs)可與白色念珠菌細胞壁上的甘露聚糖黏附，將其募集到早期生物膜上[6-7]。FALSETTA的動物模型也證明了它們的協(xié)同作用增強了生物膜的毒力，導(dǎo)致類似ECC的猖獗性齲病的發(fā)生[8]。

傳統(tǒng)的防治齲齒手段有機械治療、抗生素、天然植物提取物療法。機械療法受人為意愿限制，效果較為表面；大部分的抗生素會破壞菌群的正常生態(tài)，同時增強致病菌的耐藥性[9]。近年，天然植物提取物的防齲研究取得了一定進展。饒瑞瑛等[10]研究表明，白芨提取物對變異鏈球菌有抑菌和抑制生物膜形成的作用，且生物膜活性隨使用藥物濃度的上升而降低。PHILIP等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蔓越莓提取物能顯著降低變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜的代謝活性和產(chǎn)酸性，并破壞雙菌生物膜的結(jié)構(gòu)。王小玉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬精油能夠顯著降低變異鏈球菌和白色念珠菌在雙菌生物膜中的存活率并抑制雙菌生物膜的形成。然而植物提取物作用機制復(fù)雜且尚不明確，加之本身味道的限制，也難以使大眾普遍接受[13]。

乳酸菌作為對人體有益的活性微生物，能夠從根源上破壞致齲毒力并調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)平衡且無副作用，受到了越來越多的關(guān)注和歡迎。CIANDRINI等[14-17]在體外篩選并驗證了特定乳酸菌對變異鏈球菌生物膜和致齲細菌生物膜的抑制作用，而乳酸菌對變異鏈球菌與白色念珠菌的雙菌生物膜的抑制作用，少有人研究。因此，本研究在體外篩選了1株對雙菌生物膜具有抑制作用的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8724，并驗證了它在不同時期對雙菌生物膜的破壞效果。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

變異鏈球菌(Streptococcusmutans)ATCC25175；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8724分離自健康人的糞便，白色念珠菌(Candidaalbicans)50-1分離自患齲兒童的牙菌斑。

1.2 材料和試劑

MRS、YPD培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；TSB培養(yǎng)基，美國BD Difco公司；Live/Dead?BacLightTM活死菌熒光染色試劑盒(L34856)，美國Thermo Fisher公司；溶菌酶，上海生工生物工程有限公司；結(jié)晶紫、蒽酮、乙醇等化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；SW-CJ-1CV型微生物操作超凈工作臺，安泰空氣技術(shù)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Multiscan Go全波長酶標儀，美國Thermo Fisher公司；QUANTA 200?掃描電鏡，荷蘭FEI公司；LSM 710激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)和菌懸液制備

取凍存甘油管中的乳桿菌、變異鏈球菌和白色念珠菌，分別在MRS、TSB和YPD平板上劃線活化2次后，挑單菌落接入對應(yīng)液體培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)24 h。制備菌懸液需收集菌體，調(diào)整菌懸液濃度：乳桿菌和變異鏈球菌107CFU/mL，白色念珠菌106CFU/mL。

1.4.2 上清液的制備

乳桿菌液培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液于12 000 r/min條件下離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后存于-20 ℃，備用。

1.4.3 生物膜量測定

于96孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液每孔各50 μL，在0、6、12 h加入CCFM8724上清液100 μL，37℃培養(yǎng)24 h。24 h上清液介導(dǎo)生物膜的方法：于96孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液每孔各50 μL，培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗生物膜2遍，加入CCFM8724上清液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照以空白MRS替代上清液。用結(jié)晶紫染色法測定生物膜量[18]。生物膜量減少率計算如公式(1)所示：

(1)

1.4.4 生物膜水不溶性胞外多糖產(chǎn)量測定

于24孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液,每孔各1 mL，在0、6、12 h加入CCFM8724上清液150 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h。24 h上清液介導(dǎo)的方法：雙菌生物膜培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗生物膜2遍，加CCFM8724上清液2 mL，再培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后用1 mL PBS將生物膜洗脫，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，6 000×g離心10 min后棄上清液，重復(fù)洗3遍，根據(jù)REN等[19]的方法加入1 mL NaOH提取水不溶性胞外多糖，以蒽酮-硫酸法測定胞外多糖含量。胞外多糖減少率如公式(2)所示

胞外多糖減水率/%=

(2)

1.4.5 熒光染色觀察生物膜中活死菌比例

在6孔板中放入18 mm×18 mm無菌蓋玻片，加入致病菌菌懸液各2 mL，在0、6、12、24 h加入CCFM8724上清液250 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)Live/Dead?BacLightTM活死菌熒光染色試劑盒的操作流程將生物膜避光染色30 min，在激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)下觀察。參考SHANG等[20]的方法在Zen 2010軟件下掃描分析。

1.4.6 生物膜中致病菌活菌數(shù)計數(shù)

方法同1.4.5(在24 h加入CCFM8724上清液)。培養(yǎng)結(jié)束后將長有生物膜的蓋玻片置于生理鹽水中，超聲洗脫生物膜[21]，梯度稀釋生物膜懸液，澆注計數(shù)。

1.4.7 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察生物膜結(jié)構(gòu)變化

方法同1.4.5(在0 h加入CCFM8724菌液)。按BARBOSA等[22]的方法將生物膜制成樣本后置于掃描電鏡下觀察。

1.4.8 乳桿菌對唾液包被羥基磷灰石脫鈣量測定

將唾液包被的羥基磷灰石片(saliva-coated hydroxyapatite discs, SHA)放入6孔板中，方法同1.4.5，于0 h加入CCFM8724菌液250 μL，培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)液在8 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液，并測pH和鈣離子濃度。SHA模型建立參考WU等[16]的方法，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)測定鈣離子。鈣流失比如公式(3)所示

(3)

1.4.9 乳桿菌溶菌酶耐受能力測定

采用分光光度法考察CCFM8724對溶菌酶的耐受能力[23]。將乳桿菌菌懸液接種至96孔培養(yǎng)板，分別添加不同濃度的溶菌酶溶液使得終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0 mg/mL。培養(yǎng)結(jié)束后于OD600下測吸光度。對照組用無菌水代替溶菌酶溶液。

1.4.10 統(tǒng)計學分析

本研究采用SPSS Statistics 25.0單因素方差(One-Way，ANOVA)對實驗結(jié)果進行顯著性分析。采用Graphpad Prism 8.0進行作圖和分析。設(shè)置顯著性水平為0.05，P<0.05表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果呈顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物膜形成量的分析

生物膜的形成階段包含了4個關(guān)鍵時間點：0 h，細菌的初始黏附；6 h，細菌的初始定植；12 h，早期生物膜的形成；24 h，生物膜的成熟[24]。分別在4個關(guān)鍵時間點加入CCFM8724上清液進行介導(dǎo)，并計算不同時期介導(dǎo)后的生物膜成膜量和生物膜量減少率。其中生物膜形成前中期(0、6、12 h)的介導(dǎo)組皆以12 h組(空白MRS代替上清液)為對照。結(jié)果如圖1所示，24 h對照生物膜(空白MRS代替上清液)比12 h對照生物膜在生物膜量上沒有顯著的增長(P<0.05)；每個時間點介導(dǎo)都顯著地減少生物膜量(P<0.05)，減少率依次為89.74%、82.13%、75.35%和76.61%，減少量均>70%。表明CCFM8724在不同時間介導(dǎo)都能抑制雙菌生物膜生成，前、中期(0～12 h)的生物膜減少量呈線性下降趨勢，對24 h成熟生物膜的抑制效果也較好，與12 h介導(dǎo)形成的生物膜量并無顯著性差別。

圖1 不同時間CCFM8724介導(dǎo)雙菌生物膜的生物膜量(a)和生物膜量減少率(b)

2.2 生物膜胞外多糖產(chǎn)量分析

水不溶性胞外多糖是生物膜基質(zhì)的最主要成分，這些基質(zhì)形成了一種三維立體的結(jié)構(gòu)，富含空隙和管道系統(tǒng)，而微生物就被包埋在了它們自身產(chǎn)生的這些胞外聚合物基質(zhì)中[25]。如圖2顯示，0、6、12 和24 h四個時間介導(dǎo)的胞外多糖產(chǎn)量與對照組有顯著差異(P<0.05)，依次減少率為82.19%、64.64%、46.32%,和48.47%, 其中0 h產(chǎn)量最少，與2.1結(jié)果一致，推測可能是由于乳桿菌上清液中的抑菌產(chǎn)物發(fā)揮了作用，對致病菌的初始黏附造成了影響。另外，4個時間點對生物膜水不溶性胞外多糖減少趨勢與生物膜量的減少趨勢大致相同。結(jié)果表明，CCFM8724在不同時間介導(dǎo)都能顯著降低雙菌生物膜胞外多糖的產(chǎn)量，減少生物膜基質(zhì)的形成，且乳桿菌介導(dǎo)時間越早效果越好。

圖2 蒽酮-硫酸法測定的雙菌生物膜水不溶性胞外多糖量產(chǎn)量(a)和減少率(b)

2.3 激光共聚焦3D圖分析

為了觀察不同時間介導(dǎo)下生物膜的活性，采用雙染法區(qū)分活細胞(綠色)和死細胞(紅色)，3D生物膜圖像如圖3所示。CCFM8724上清液在0 h介導(dǎo)后，染色并未觀察到相應(yīng)的細胞黏附，推測是由于乳桿菌在0 h介導(dǎo)時直接抑制了變異鏈球菌和白色念珠菌生長，影響了生物膜的形成；介導(dǎo)越早菌體覆蓋越少，24 h介導(dǎo)雖然還是形成了較大面積的菌體覆蓋，但是生物膜的厚度顯著減少，且死菌比例大幅上升，該生物膜活性顯著降低，說明CCFM8724對成熟生物膜的菌體面積減少不顯著，但可以大大降低生物膜活性。與對照生物膜相比，不同介導(dǎo)時間的生物膜厚度均顯著降低，尤其在24 h介導(dǎo)時生物膜厚度最低，表明CCFM8724不但降低了成熟生物膜活性還減少了生物膜中菌體的厚度。實驗結(jié)果與ZHANG等[26]研究結(jié)果類似，乳桿菌能夠減少生物膜菌體覆蓋面積和厚度、尤其是生物膜中活死菌比例，從而降低生物膜活性。

a-24 h雙菌生物膜對照組;b-6 h乳桿菌介導(dǎo)組;c-12 h乳桿菌介導(dǎo)組;d-24 h乳桿菌介導(dǎo)組

2.4 生物膜中致病菌計數(shù)結(jié)果分析

由于成熟生物膜對菌體的保護作用較強，許多治療劑在作用于細菌之前就與生物膜中的胞外多糖結(jié)合，從而失去效用[27]，這也是抗菌劑和抗生素在臨床上防治齲齒效果不佳的原因之一。為了探究乳桿菌對生物膜中菌體的抑制效果，對24 h介導(dǎo)的生物膜中致病菌進行計數(shù)。結(jié)果如表1所示，雙菌生物膜中變異鏈球菌為7.1 lg CFU/mL，顯著高于CCFM8724上清液介導(dǎo)后的濃度4.2 lg CFU/mL(P<0.05)；而CCFM8724介導(dǎo)后白色念珠菌濃度為3.9 lg CFU/mL，顯著低于對照組6.2 lg CFU/mL(P<0.05)。

表1 生物膜中致病菌活死菌計數(shù)結(jié)果 單位：lg CFU/mL

結(jié)果表明，CCFM8724能夠顯著減少成熟生物膜中的致病菌數(shù)，推測CCFM8724可能通過穿透生物膜基質(zhì)對致病菌發(fā)揮抑菌效果。

2.5 掃描電鏡圖分析

白色念珠菌是常見的條件致病菌，它的酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變通常增強其致病性，同時能為變異鏈球菌提供更多黏附位點[28]。從圖4-a和圖4-b的對照生物膜可以看出，生物膜具有一定厚度，呈明顯的波浪狀；變異鏈球菌呈鏈狀排列，緊緊附著在酵母細胞上，酵母菌菌絲在凸起的生物膜基質(zhì)中縱橫交錯。從圖4-c和圖4-d可以看出，與CCFM8724共培養(yǎng)后，生物膜厚度明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，變異鏈球菌和白色念珠菌細胞數(shù)量驟減，沒有明顯的胞外基質(zhì)，酵母菌菌絲也未可見。許多生物膜結(jié)構(gòu)包含了環(huán)境流體可以通過的通道，這些通道通常充當輸送營養(yǎng)物質(zhì)、清除廢物和作為信使分子的運輸管道，生物膜結(jié)構(gòu)的破壞也會影響生物膜整體的生理活性[29]。結(jié)果表明，CCFM8724破壞了致齲雙菌生物膜的結(jié)構(gòu)，又抑制了白色念珠菌毒力因子菌絲的形成，生物膜失去了菌絲的支撐，變異鏈球菌的黏附位點也大大減少，生物膜從致密的結(jié)構(gòu)變得疏松且基質(zhì)厚度明顯減少。

a,b-對照生物膜(×1 200，×2 400)；c,d-與CCFM8724共培養(yǎng)的生物膜(×1 200，×2 400)

2.6 乳桿菌對SHA模型脫鈣分析

齲齒的發(fā)生是一個致齲生物膜中的細菌產(chǎn)酸對牙齒進行脫礦的過程，而此過程往往伴隨著鈣離子的流失。乳桿菌與SHA模型上雙菌生物膜共培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液的pH值和SHA的脫鈣情況來判斷乳桿菌對致齲環(huán)境中的牙齒是否有保護作用(表2)。

由表2可以看出CCFM8724與雙菌生物膜共培養(yǎng)后顯著提升了培養(yǎng)液的pH值，減少了生物膜的脫鈣量，從口腔乳桿菌的益生特性上分析，CCFM8724對齲菌斑牙齒有一定保護作用。

表2 唾液包被羥基磷灰石的脫鈣量和培養(yǎng)液pH

2.7 CCFM8724對溶菌酶耐受能力分析

從圖5可以看出，CCFM8724在溶菌酶質(zhì)量濃度為0～1.6 mg/mL時，生長情況基本不受影響，而溶菌酶質(zhì)量濃度達到2.0 mg/mL時，菌體生長的吸光度值驟然減少，為對照的37.5%，可推測CCFM8724對溶菌酶耐受的臨界值介于1.6～2.0 mg/mL。根據(jù)人口腔溶菌酶質(zhì)量濃度為0～57 μg/mL[30]，說明該乳桿菌在口腔中有一定存活能力。

圖5 CCFM8724在不同濃度溶菌酶下生長情況

3 結(jié)論

變異鏈球菌、白色念珠菌和乳桿菌都是口腔中常見的微生物。與腸道菌群類似，口腔菌群也處于動態(tài)平衡中，一旦動態(tài)平衡遭到破壞，致齲的微生物將成為優(yōu)勢菌從而形成具有致齲毒力牙菌斑生物膜。而采用益生菌療法以乳桿菌干預(yù)致齲微生物膜的過程，即對口腔微生態(tài)的重新調(diào)整，可以讓有益菌成為優(yōu)勢菌維持口腔健康。本研究證明，植物乳桿菌CCFM8724上清液在不同時間點介導(dǎo)能夠減少雙菌生物膜的生物膜量、水不溶性胞外多糖產(chǎn)量并降低生物膜活性，不僅可以顯著減少初始生物膜的黏附，對24 h成熟生物膜依然有較好的抑制作用。乳桿菌與致病菌共培養(yǎng)后的生物膜結(jié)構(gòu)明顯松散、稀疏且看不見白色念珠菌的菌絲和起伏的生物膜基質(zhì)，對生物膜結(jié)構(gòu)的破壞作用也十分顯著。綜上，植物乳桿菌CCFM8724在體外實驗中表現(xiàn)出了較好地抑制變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜效果，為CCFM8724在防治幼兒齲齒上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為進一步驗證益生菌在體內(nèi)的功效并開發(fā)功能益生菌產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。