任偉綺，陳 鈺，劉仲明，王 捷

（南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，廣州510010）

0 引言

傳染病嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，平均每年有1 700 多萬人死于各種傳染病，約占全球死亡人數(shù)的30%[1]，主要分布于中低收入國家。實現(xiàn)傳染病病原體的精準(zhǔn)、快速、低成本檢測對傳染病的防治尤為重要。雖然目前有許多有效檢測病原體的方法，如平板培養(yǎng)、顯微鏡直接觀察法、基因組擴(kuò)增和免疫檢測等，但這些方法各有缺點，在貧瘠、條件有限的疫區(qū)并不適用。如病原體培養(yǎng)方法費時，通常需要數(shù)天或數(shù)周才能產(chǎn)生結(jié)果，而提前經(jīng)驗性使用抗生素可能會導(dǎo)致耐藥菌的流行；顯微鏡檢僅限于鏡下查找病原體，存在現(xiàn)場檢測靈敏度低的問題；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）通常依賴昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員。此外，在貧瘠偏遠(yuǎn)的疫區(qū)，生物樣本往往被集中轉(zhuǎn)運到上級醫(yī)院或?qū)嶒炇疫M(jìn)行檢測，在數(shù)天或數(shù)周后方可收到檢查結(jié)果，嚴(yán)重降低了偏遠(yuǎn)疫區(qū)的診治效率。世界衛(wèi)生組織針對中低收入國家在傳染病床旁診斷所面臨的復(fù)雜狀況、多樣性需求以及各種障礙，提出了即時檢測（point-of-care testing，POCT）解決方案并創(chuàng)建了ASSURED 原則，即可支付（affordable）、特異（specific）、敏感（sensitive）、用戶友好（user-friendly）、檢測迅速可靠（rapid and robust）、無需設(shè)備或者設(shè)備簡單（equipment free or minimal equipment）、易于攜帶（deliverable to end-users）。

近年來，檢測病原體標(biāo)志物（DNA/RNA、糖蛋白、酶、抗體等）的生物傳感技術(shù)陸續(xù)出現(xiàn)，其通?；诩{米、微流控技術(shù)，依賴光、電、磁等檢測方法，雖然產(chǎn)生陽性信號的機(jī)制各不相同，但都可通過優(yōu)化檢測條件或結(jié)合其他技術(shù)成為傳染病病原體POCT的有力工具，實現(xiàn)病原體的快速檢測。本文根據(jù)檢測方法的不同，對基于光學(xué)、電化學(xué)、磁學(xué)的生物傳感技術(shù)在傳染病病原體POCT 中的研究進(jìn)展及其應(yīng)用的優(yōu)缺點進(jìn)行綜述。

1 光學(xué)、電化學(xué)、磁學(xué)生物傳感技術(shù)在傳染病病原體POCT 中的研究進(jìn)展

1.1 光學(xué)檢測

1.1.1 熒光偏振法

熒光偏振法是一種常用的熒光分析方法，通過對探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后探針與靶分子相互作用，從而產(chǎn)生偏振光。熒光偏振法與其他的熒光免疫檢測方法相比，樣本制備簡單，已被用于流感[2]、結(jié)核分枝桿菌[3]、沙門菌[4]和布魯氏菌[5]等病原體的檢測。在免疫診斷方面，Gwida 等[6]分別應(yīng)用虎紅平板凝集試驗（Rose-Bengal plate agglutination test，RBPT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗（complement fixation test，CFT）、試管凝集試驗（standard tube agglutination test，SAT）、競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定（competitive enzyme linked immunosorbent assay，cELISA）和熒光偏振免疫分析方法（fluorescence poliarization immunoassy，F(xiàn)PIA）對來自蘇丹的895 份駱駝血清進(jìn)行布魯氏菌的檢測，結(jié)果顯示FPIA 陽性率為79.3%，明顯高于CFT（71.4%）、RBT（70.7%）、SAT（70.6%）和cELISA（68.8%）。實時定量熒光PCR 對傳染病潛伏期的檢測敏感度高但特異度低，而該方法同時具有很高的敏感度和特異度。在分子診斷方面，Zhang 等[2]報道了一種基于功能性量子點熒光探針及雙功能蛋白結(jié)合適配體的甲型流感病毒熒光偏振檢測平臺，其線性范圍為10～100 nmol/L，檢測限為3.45 nmol/L。Park 等[4]利用熒光偏振法檢測沙門氏菌，并對不同亞型的沙門氏菌（如鼠傷寒桿菌和副傷寒桿菌）進(jìn)行鑒別，檢出限為1 cfu/ml，檢測完成時間為20 min。與傳統(tǒng)的PCR 檢測方法相比，該方法具有簡便、快速、成本低、無需洗滌、受環(huán)境影響小等優(yōu)點，結(jié)合微型PCR 儀和光學(xué)檢測器，有望構(gòu)建一個強(qiáng)有力的傳染病病原體生物傳感POCT平臺。

1.1.2 表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）法

SPR 是一種光學(xué)現(xiàn)象，利用全反射時入射光與金屬表面的等離子體發(fā)生共振的原理，實時跟蹤天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用（如圖1 所示）[7]。SPR技術(shù)有諸多優(yōu)點，如樣品用量少、檢測速度快、靈敏度高[8]。SPR 與芯片技術(shù)結(jié)合，既可以充分發(fā)揮SPR高特異度、高靈敏度、不需標(biāo)記及純化、實時等特點，又可進(jìn)一步結(jié)合基因芯片高通量的特點，從而快速、簡單、準(zhǔn)確地實現(xiàn)基因的定性和定量檢測[9]。田玉峰等[10]利用SPR 型基因芯片系統(tǒng)成功檢測出金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌、洛菲不動桿菌、銅綠假單胞菌、淋球菌及人類乳頭瘤病毒，其檢測結(jié)果與臨床常規(guī)檢測結(jié)果一致。該方法取代了現(xiàn)有芯片的標(biāo)記檢測技術(shù)，實現(xiàn)了SPR 技術(shù)的高通量檢測，整個過程簡便且易于自動化，為臨床病原微生物的早期發(fā)現(xiàn)及準(zhǔn)確診斷提供了一定的理論和實驗依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。Taylor 等[11]利用多通道SPR 儀實現(xiàn)了同時對4 種食源性病原菌（大腸埃希菌O157：H7、鼠傷寒沙門菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌和空腸彎曲菌）的定量檢測，檢出限為3.4×103～1.2×105cfu/ml。Hu 等[12]通過SPR 生物分析系統(tǒng)對豬圓環(huán)病毒Ⅱ型進(jìn)行檢測，檢測一個樣品的時間約為20 min，檢出限達(dá)到0.04 mg/ml。

圖1 表面等離子共振原理圖[7]

具有代表性的光學(xué)檢測方法及基本情況匯總詳見表1。

1.2 電化學(xué)檢測

1.2.1 伏安法

伏安法是電勢控制法的一種，這類方法的電極電勢強(qiáng)制依附于已知程序，電勢控制在恒定值或者按預(yù)先確定的方式隨時間變化，通過記錄電流與時間或電勢的關(guān)系從而獲得分析結(jié)果[13]。Ng 等[14]利用鏈霉親和素與生物素具有高親和力的特點，用金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）電化學(xué)法檢測結(jié)核分枝桿菌，通過檢測電極表面AuNPs 偶聯(lián)物的差分脈沖伏安信號的變化即可定量獲得靶核酸濃度（如圖2 所示），最低檢測濃度達(dá)1 cfu/ml，比傳統(tǒng)的凝膠電泳靈敏度更高，可應(yīng)用到便攜式恒電位儀上，進(jìn)一步開發(fā)為POCT 診斷工具。Miao 等[15]將微機(jī)電系統(tǒng)（micro-electro-mechanical system，MEMS）與適配體結(jié)合，開發(fā)了一種小型便攜式電化學(xué)傳感器，用于簡單、靈敏、快速地檢測諾如病毒，采用循環(huán)伏安法和方波伏安法（Osteryoung square-wave voltammetry，OSWV）對不同滴度病毒進(jìn)行電化學(xué)測試，結(jié)果顯示電流大小與病毒濃度呈線性關(guān)系，實現(xiàn)了諾如病毒的定量檢測。這種便攜式MEMS 傳感器也可用于其他微生物病原體的檢測，具有發(fā)展為傳染病病原體生物傳感POCT 平臺的潛力。Grabowska 等[16]將金屬碳硼烷氧化還原標(biāo)記的寡核苷酸探針固定在金電極表面，對甲型H5N1 流感病毒進(jìn)行檢測，用OSWV 記錄雜交時產(chǎn)生的信號，檢出限為0.08 fmol/L。

表1 具有代表性的光學(xué)檢測方法及基本情況對照

圖2 伏安法檢測結(jié)核分枝桿菌示意圖[14]

1.2.2 電阻抗法

電阻抗法是近年來發(fā)展起來的一項電化學(xué)技術(shù)，其和微生物檢測相結(jié)合形成一個獨立的研究領(lǐng)域[17]。電阻抗技術(shù)是根據(jù)微生物在培養(yǎng)基中代謝活動的不同，通過檢測培養(yǎng)基電阻抗的變化，判定細(xì)菌的生長繁殖特性，即可檢測出相應(yīng)細(xì)菌。Wheeler 等[18]使用一種基于阻抗變化原理的電壓檢測器檢測培養(yǎng)基或尿液標(biāo)本中的大腸桿菌，檢測范圍為1×103～1×109cfu/ml，這項技術(shù)省略了平板計數(shù)等方法漫長的實驗過程，在10～15 min 內(nèi)即可確定細(xì)菌濃度，可有效用于臨床菌尿癥標(biāo)本檢測，缺點是無法檢測代謝物的變化。András 等[19]研制了一種超靈敏基于聚糖的阻抗生物傳感器，用于流感病毒H3N2 檢測，其檢出病毒顆粒的濃度約為13 個/μl。Maalouf 等[20]利用生物素-親和素的特性將大腸桿菌抗體與金電極表面的自組裝膜結(jié)合，用電化學(xué)阻抗傳感器（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）可檢測出1×103cfu/ml 大腸桿菌。EIS 方法靈敏度高、特異度強(qiáng)，在生物傳感POCT 中有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2.3 電壓或電流法

電壓或電流法是將電極與電位計或電流計連接，記錄工作電極上的電位或電流，隨著電解池中氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行并通過適當(dāng)?shù)拿浇椋瑢⑽⑸锏难趸€原反應(yīng)轉(zhuǎn)換為可測量的電信號[13]。Sepunaru等[21]將納米粒子作為傳感器的一部分，通過銀納米顆粒所致的電信號變化檢測流感病毒。由于產(chǎn)生的電流峰值大小與溶液中病毒的濃度成正比，因此可用于病毒等病原體的定量檢測，優(yōu)點是設(shè)備微型化、自動化，靈敏度高、選擇性強(qiáng)、診斷時間短。盡管不能確定具體的病毒種類，但能簡單區(qū)分病毒和細(xì)菌感染。

具有代表性的電化學(xué)檢測方法及基本情況匯總詳見表2。

1.3 磁學(xué)檢測

1.3.1 電磁法

目前，有研究使用磁性納米顆粒（magnetite nanoparticle，MNPs）構(gòu)建有潛力的POCT 診斷平臺，用于檢測大腸桿菌[22]、流感病毒[23]、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌[24]和炭疽芽孢桿菌[25]。Shelby 等[23]利用包被聚丙烯酸涂層的超順磁性氧化鐵納米粒子設(shè)計能夠檢測和區(qū)分各種流感病毒糖蛋白的磁弛豫納米傳感器（magnetic relaxation nanosensors，MRnS），通過收集并分析橫向弛豫時間來進(jìn)行研究。MRnS 能區(qū)分糖蛋白變異體，可檢測濃度低至1 nmol/L 的流感病毒糖蛋白（H1 和H5）。此外，MRnS 可在30 min 內(nèi)完成檢測，操作簡單、便攜，只需要一個臺式磁弛豫儀即可進(jìn)行樣品分析。MRnS 具有穩(wěn)定和成本低廉的特點，有望成為有價值的POCT 候選診斷方法。Krishna 等[26]構(gòu)建了基于單克隆抗體和磁性納米粒子的巨磁電阻（giant magnetoresistance，GMR）生物傳感器（如圖3所示），可用臺式計算機(jī)通過檢測磁場變化來檢測甲型流感病毒，MNPs 的數(shù)量與甲型流感病毒的數(shù)量成正比。該方法靈敏度優(yōu)于ELISA，病毒濃度最低檢出限為1.5×102TCID50/ml。此外，GMR 生物傳感芯片包含64 個磁珠陣列計數(shù)器，可與各種抗體結(jié)合檢測病毒的不同亞型，甚至可以同時檢測多種病原體，雖然檢測時間較長且操作復(fù)雜，但有發(fā)展為手持生物傳感POCT 設(shè)備的潛力。

表2 具有代表性的電化學(xué)檢測方法及基本情況匯總

圖3 GMR 芯片[26]

1.3.2 磁光法

磁光效應(yīng)是指在磁場作用下，物質(zhì)的磁性（磁導(dǎo)率等）發(fā)生變化，使光在其內(nèi)部的傳輸特性（偏振狀態(tài)、傳輸方向等）也隨之變化的現(xiàn)象。Bejhed 等[27]運用磁光技術(shù)，可在20 min 內(nèi)完成濃度為5 pmol/L 的霍亂弧菌檢測，但滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)60 min 后檢測限僅為10 pmol/L。Tian 等[28]用bluray 磁光法3 h 內(nèi)完成濃度低至8×104cfu/ml 的沙門氏菌檢測，可以直接得到檢測結(jié)果，而且檢出限比磁雜散場檢測裝置低20 倍。Kim 等[29]利用塑料芯片-磁光免疫分析法檢測結(jié)核桿菌，通過將塑料芯片與自動分光光度計裝置相結(jié)合，可在1 h 內(nèi)完成濃度低至1.8 pg/ml 的結(jié)核桿菌檢測。磁光法因具有快速靈敏、使用簡便、成本低廉和穩(wěn)定性較好的特點，成為了新型生物傳感POCT 檢測的另一個潛在候選者。

具有代表性的磁學(xué)檢測方法及基本情況匯總詳見表3。

表3 具有代表性的磁學(xué)檢測方法及基本情況匯總

2 3 種檢測方法在傳染病病原體POCT 應(yīng)用中的優(yōu)劣比較

光學(xué)檢測具有高通量、集成化且可根據(jù)個人需要進(jìn)行熒光標(biāo)記的特點，但仍存在局限性，例如在樣本準(zhǔn)備過程中熒光分子固有的本底干擾多且不易去除，熒光檢測儀費用昂貴。另外，現(xiàn)有的SPR 技術(shù)與傳統(tǒng)分析方法相比，在穩(wěn)定性、易用性、靈敏度、檢測效率及成本等方面還存在一些不足[30]。POCT 診斷工具的目標(biāo)是使用原始樣本，如血液、血清或尿液，盡量減少樣本前處理過程，而光學(xué)檢測方法樣本前處理過程一般較為復(fù)雜且需專業(yè)人員操作，因此進(jìn)一步限制了光學(xué)生物傳感POCT 平臺在資源有限環(huán)境中的應(yīng)用。

電化學(xué)技術(shù)具有成本低、可批量生產(chǎn)、靈敏度高及一次性可拋的特點，但研發(fā)時間較長、壽命短、選擇性差。雖然目前已研發(fā)出具有便攜性和精確性的病原體檢測原型機(jī)，但在評估有效性方面還存在一些困難[31]。

磁性納米粒子檢測克服了熒光檢測的許多不足，可用于非透明和未經(jīng)處理的樣本。此外，磁性納米粒子具有超順磁性、高磁化率、高矯頑力與低居里溫度等特性[32]，并且可被磁場操控，在研發(fā)各種診斷工具時可以進(jìn)行豐富的個性化定制。然而，儀器缺乏便攜性和成本問題限制了該類平臺的應(yīng)用。

3 種檢測方法主要的優(yōu)缺點匯總詳見表4。

表4 3 種檢測方法優(yōu)缺點比較

3 結(jié)語

因具有高通量和高速傳輸?shù)奶攸c，基于光學(xué)的生物傳感POCT 平臺具有很大的潛力，但成本、樣本處理及專業(yè)性等問題限制了其在資源有限環(huán)境中的應(yīng)用，現(xiàn)多與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合用于病原體的即時檢測。電化學(xué)技術(shù)在傳染病病原體生物傳感POCT 方面最具發(fā)展?jié)摿?，該類生物傳感器逐漸向小型化和便攜化方向發(fā)展。磁性納米粒子因其獨特的化學(xué)和物理性能，在病原體即時檢測方面有一定的應(yīng)用前景。每種檢測方法都能夠成為有效的生物傳感POCT診斷工具，從而實現(xiàn)傳染病病原體的快速檢測。

盡管如此，生物傳感POCT 技術(shù)與設(shè)備在傳染病病原體檢測中仍存在以下問題：（1）靈敏度和準(zhǔn)確性有待提高；（2）檢測病原體的類型較為單一，單次檢測的樣本數(shù)量少；（3）目前多處于實驗室研究階段?？梢灶A(yù)見，傳染病病原體生物傳感POCT 未來發(fā)展趨勢：（1）靈敏、快速、高度集成化，實現(xiàn)加樣檢測一體化；（2）配備自動化、小型化，在偏遠(yuǎn)疫區(qū)非專業(yè)人員也可輕松操作；（3）控制智能化、遠(yuǎn)程化，通過便攜式計算機(jī)或手機(jī)即可啟動或停止檢測；（4）多元化、高通量、多種技術(shù)聯(lián)合檢測。

綜上所述，通過聚焦于低成本、高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度及便攜性，建立有效的評估方法，加快新技術(shù)研發(fā)，生物傳感技術(shù)將會在傳染病病原體POCT 方面得到更廣泛的應(yīng)用。