庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其產(chǎn)酶特性

劉曉靜,楚 敏,朱 靜,顧美英,唐琦勇,孫 建,朱 璇,*,張志東,,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830091)

植物內(nèi)生菌泛指生活在植物組織內(nèi),暫時不引起宿主出現(xiàn)明顯病害癥狀的微生物,包括表面生活的腐生微生物和潛伏性病原微生物[1]?，F(xiàn)有研究表明,所有植物中均存在豐富的內(nèi)生菌,但人類僅研究了其中很小的一部分,絕大多數(shù)還處于未知狀態(tài)[2]。對眾多瓜果實(shí)內(nèi)生菌的研究表明,其內(nèi)生菌數(shù)量、種群等易受宿主種類、生長階段及環(huán)境的影響[3-5]。同時,隨著宿主生長階段的變化,及其中纖維素酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等相關(guān)物質(zhì)的變化,有些在前期無害的內(nèi)生菌可能會引起宿主的病害[6]。因此,研究植物內(nèi)生菌不僅對進(jìn)一步研究微生物的環(huán)境適應(yīng)性、群落演替和微生物資源挖掘有重要研究價(jià)值,也對果蔬貯藏保鮮、防病治病有著重要應(yīng)用價(jià)值。

庫車小白杏因盛產(chǎn)于新疆阿克蘇地區(qū)庫車縣而得名,是新疆的特色水果之一。其鮮果成熟期集中,貯存期短,易腐敗變質(zhì)。目前普遍認(rèn)為,小白杏的腐敗變質(zhì)除了與其采后理化過程相關(guān)外,主要與真菌侵染有關(guān),但國內(nèi)外對細(xì)菌在其中發(fā)揮的潛在作用鮮有研究。前期研究發(fā)現(xiàn),隨著庫車小白杏采后成熟度的增加,其菌群組成結(jié)構(gòu)存在明顯的更替。高通量測序結(jié)果進(jìn)一步證明了,小白杏內(nèi)生細(xì)菌中存在一些與植物軟腐相關(guān)的病原菌,可能與庫車小白杏采后的軟化腐敗有關(guān),如泛菌屬類菌群隨著成熟的推進(jìn),其所占比例增加了近416 倍,葡糖桿菌屬類菌群則增加了約17.5 倍[7]。因此,解析庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落組成并篩選相關(guān)內(nèi)生細(xì)菌,為揭示和驗(yàn)證庫車小白杏采后腐敗變質(zhì)的內(nèi)在機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究采用高通量測序法結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法,對庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析,并對其產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶特性進(jìn)行研究,旨在揭示庫車小白杏果實(shí)可培養(yǎng)微生物群落多樣性,同時,從活性酶產(chǎn)生菌的角度解析其與果實(shí)軟腐的潛在關(guān)系,為進(jìn)一步開發(fā)庫車小白杏的貯藏保鮮方法、挖掘相關(guān)活性物質(zhì)等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫車小白杏于2018年6月采自庫車縣烏恰鎮(zhèn)小白杏果園中,根據(jù)成熟等級,選擇果實(shí)自然成熟,無機(jī)械傷痕,無病變,且表皮有光澤,顏色、大小、硬度等表觀一致的小白杏(約(2.0～2.5)cm×(2.5～3.0)cm),經(jīng)發(fā)泡網(wǎng)包裹裝筐后,12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)研究室,于4 ℃貯藏,并在48 h內(nèi)盡快開展相關(guān)表面消毒和分離篩選等工作。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):200 g馬鈴薯去皮切塊后煮30 min,過濾后加入葡萄糖20 g,瓊脂18 g,pH 7.0左右;察式培養(yǎng)基:硝酸鈉3 g、氯化鉀0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、七水硫酸鎂0.5 g、蔗糖30 g、瓊脂17 g,pH 6.0左右;種子瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、酵母粉5 g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂15 g、乙醇15 mL、瓊脂18 g,pH 6.5左右;蛋白酶篩選培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基中加入脫脂牛奶20 g;脂肪酶篩選培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基中加入75 mL三丁酸甘油酯乳化液(15 mL三丁酸甘油酯加入60 mL 2%聚乙烯醇溶液,加熱,160 Hz超聲10 min,間隔2 s);纖維素酶篩選培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基中加入羧甲基纖維素鈉2 g;果膠酶篩選培養(yǎng)基:酵母粉5 g、CaCl2·2H2O 0.5 g、聚果膠酸鈉10 g、2% NaOH 9 mL、溴百里酚藍(lán)0.2%溶液12.5 mL,瓊脂8 g,121 ℃高壓滅菌不超過15 min;胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar,TSA)、高氏一號培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的表面消毒

庫車小白杏經(jīng)自來水流水沖洗10 min,無菌濾紙吸干水分,75%乙醇溶液處理5 min,經(jīng)無菌水洗滌,3%H2O2溶液浸泡3 min,再用無菌水沖洗3～4 次,最后一次無菌水洗滌液經(jīng)涂板檢測無菌后,備用。

1.3.2 總DNA的提取

經(jīng)表面消毒的庫車小白杏,采用十六烷基三甲基溴化銨(etyltrimethylammonium-ammonium bromide,CTAB)法[8]對樣本的基因組DNA進(jìn)行大量提取,設(shè)置3 個重復(fù),經(jīng)凝膠電泳檢測DNA濃度及純度合格后,作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增模板使用。

1.3.3 16S r DNA序列V57可變區(qū)的PCR擴(kuò)增

以前述內(nèi)生菌D N A為模板,采用引物為799 F(AACMGGATTAGATACCCKG)和1 193 R(ACGTCATCCCCACCTTCC)[9],擴(kuò)增16S rRNA基因序列的V5-V7可變區(qū)。PCR條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測切膠回收,并調(diào)節(jié)檢測濃度一致,樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

所得的測序數(shù)據(jù)經(jīng)去除冗余和無效序列后,對有效序列Tags聚類,以同源性大于97%聚為一個操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),作為一個假定的分類單元。選取代表性序列,通過RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類,確定OTU之間的分類地位。

1.3.5 菌株的分離及純化

梯度稀釋法:樣品經(jīng)表面消毒后,無菌條件下去核并分別稱取200 g果肉,進(jìn)行勻漿。將組織懸液按10-1、10-2、10-3梯度稀釋至10-5,取0.1 mL組織懸液將其分別涂布在實(shí)驗(yàn)所需的各類培養(yǎng)基上,每個梯度設(shè)置3 個重復(fù),于28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每間隔24 h觀察一次培養(yǎng)皿的變化情況。

組織切塊法:選擇10 顆經(jīng)表面消毒的果實(shí),無菌條件下使用刀片將果實(shí)由外向內(nèi)進(jìn)行1 cm×1 cm的切塊,并將切塊平均切成3 段,將靠近杏核的一段放至于實(shí)驗(yàn)所需的各類培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),每顆杏果設(shè)置3 個重復(fù),于28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每間隔24 h觀察一次培養(yǎng)皿的變化情況。

待培養(yǎng)基長出菌落,于無菌條件下挑取不同形態(tài)的單菌落植于新培養(yǎng)基上再次進(jìn)行培養(yǎng)。不斷重復(fù)此操作,直至得到形態(tài)單一的菌落為止。

1.3.6 菌株的分子鑒定

采用菌落克隆方法,利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27 F和1 492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后,送往北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

所測得的序列與EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/ identify)進(jìn)行比對,并調(diào)取相似性最高模式菌株序列,使用MEGA 5.0進(jìn)行ClustalX多重比對,使用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自舉值為1 000,初步確定菌株的生物學(xué)分類地位。

1.3.7 菌株產(chǎn)酶特性的測定

將純化好的菌株接至待測培養(yǎng)基上進(jìn)行測定,于28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。果膠酶篩選可通過觀察菌落周圍的培養(yǎng)基是否有下凹,若存在該現(xiàn)象則為陽性。蛋白酶、脂肪酶篩選可直接通過觀察菌落周圍是否存在透明圈;纖維素酶篩選需用剛果紅染色后觀察菌落周圍是否有透明圈;淀粉酶篩選需用0.1%的碘液染色,在5 min之內(nèi)觀察菌落周圍是否有透明圈。以上培養(yǎng)基若存在透明圈則為陽性,根據(jù)透明圈直徑與菌落的直徑比值的比較各菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

群落組成分析、多樣性分析、功能酶活性分析及相關(guān)的方差分析等工作采用DPS v9.50、Origin 8.0 Excel 2003等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序法分析內(nèi)生細(xì)菌群落組成

通過對各樣品內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA V57區(qū)測序,總計(jì)測得原始序列113 448 條,過濾掉低質(zhì)量序列后,總數(shù)為106 202 條。所得序列經(jīng)聚類比對,以相似度低于97%聚類為1 個OTU,并去除植物體內(nèi)的線粒體、葉綠體相關(guān)序列后,共獲得406 個OTU,涉及9 個門,16 個綱,44 個目,99 個科,94 個屬。其中,在門水平上,以變形桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群。在種群多樣性方面,以假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)種群最為多樣(圖1)。其中,未分類菌群(unclassified)為絕對優(yōu)勢菌群,約占總菌群OTU數(shù)量的17.73%。其次為擬桿菌屬(Bacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、馬賽菌屬(Massilia)、勞特氏菌屬(Blautia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和蟑螂桿狀體科未分類屬(unclassified Blattabacteriaceae)。

圖1 主要菌屬OTU所占比例Fig. 1 Proportion of OTU in major genera

2.2 小白杏果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌的分離

經(jīng)不同分離培養(yǎng)基培養(yǎng)3～15 d后,根據(jù)菌落形態(tài)觀察,共挑取各類菌株235 株。通過共同接種至NA培養(yǎng)基中,觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)去重后,獲得實(shí)驗(yàn)菌株99 株。其中,采用R2A培養(yǎng)基共分離獲得菌株8 株,而常規(guī)分離培養(yǎng)基分離到菌株91 株,其占絕大多數(shù)。不同培養(yǎng)基來源菌株統(tǒng)計(jì)數(shù)情況如表1所示。

表1 主要菌屬OTU所占比例Table 1 Proportion of OTU in major genera cultured with different media

2.3 內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

上述99 株菌的16S rRNA基因序列經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序后,運(yùn)用EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/identify)進(jìn)行相似度比較。結(jié)果表明,在門水平中(圖2),厚壁菌門(Firmicutes)為所得庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌的主要菌門,約占總菌數(shù)的40%;其次為放線菌門(Actinobacteria),約占總菌數(shù)的32%;變形桿菌門(Proteobacteria)約占總菌數(shù)的26%,擬桿菌門(Bacteroidetes)僅占總菌數(shù)2%。與高通量測序結(jié)果相比較,庫車小白杏共涉及8 個門,變形桿菌門為庫車小白杏可培養(yǎng)細(xì)菌的主要菌門,約占總菌群的74%,其次為擬桿菌門和厚壁菌門分別約占總菌群的17%、8%;而放線菌門(Actinobacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和未分類菌群的所占比例均低于2%。

圖2 門水平上主要的小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落組成Fig. 2 Composition of endophytic bacterial communities in Kuqa apricots at phylum level

同時,分別調(diào)取各菌株相似性最高模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖3～5),確定庫車小白杏可培養(yǎng)細(xì)菌種類較為豐富,所得99 株菌分別屬于4 個門28 個屬。其中,變形菌門所含種屬最為豐富,共涉及11 個屬,如圖3所示,分別為產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、斯塔普氏菌屬(Stappia)和黃桿菌屬(Flavobacterium)。而擬桿菌門涉及種屬最少,僅包含類香味菌屬(Myroides)。

圖3 基于變形桿菌門和擬桿菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of isolates in the phyla Proteobacteria and Bacteroides as well as related species based on 16S rRNA gene sequences

厚壁菌門(圖4)和放線菌門(圖5)各包含8 個屬。在厚壁菌門中,分別包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、動性球菌屬(Planococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)。放線菌門中,分別為:鏈霉菌屬(Streptomyces)、類諾卡氏屬(Nocardioides)、迪茨氏屬(Dietzia)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、考克氏菌屬(Kocuria)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)。

此外,研究發(fā)現(xiàn),與高通量V 5 7區(qū)間的測序結(jié)果相比,通過分離培養(yǎng)法所得的果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、節(jié)桿菌屬(A r t h r o b a c t e r)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和類香味菌屬(Myroides)在本次高通量測序結(jié)果中卻未檢出。

圖4 基于厚壁菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of isolates in the phylum Firmicutes as well as related species based on their 16S rRNA gene sequences

圖5 基于放線菌門代表菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of isolates in the phylum Actinobacteria as well as related species based on their 16S rRNA gene sequences

2.4 小白杏果實(shí)潛在新種的發(fā)現(xiàn)

在完成測序的99 個菌株中,5 株菌與己知模式菌株序列相似性均小于98.5%(表2),初步確定為潛在新種,共涉及節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的5 個種。其中,類芽孢桿菌屬的潛在新種最多,菌株x506與最近模式菌Flavobacterium acidificum相似性最低,僅為96.98%。該結(jié)果初步表明了庫車小白杏果實(shí)中存在微生物潛在新類群(物種)資源,具體物種有待進(jìn)一步挖掘。上述菌株的最終分類地位,有待進(jìn)一步的細(xì)菌多相系統(tǒng)分類鑒定結(jié)果證明。

表2 基于16S rRNA基因序列比對結(jié)果的潛在新種Table 2 Potential novel species based on 16S rRNA gene sequence analysis

2.5 小白杏果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)酶特性分析

表3 部分菌株產(chǎn)功能酶特性Table 3 Some strains with functional enzyme activities

通過平板透明圈法或顯色圈法對所得菌株的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶產(chǎn)生能力進(jìn)行了分析(表3)。結(jié)果表明,具有淀粉酶活性的代表菌株數(shù)量最多,其次為產(chǎn)果膠酶、蛋白酶、纖維素酶類菌株,而具有脂肪酶活性的菌株的數(shù)量最少。其中,69 株菌均具有較強(qiáng)的淀粉酶活性;35 株菌具有果膠酶活性,70%的菌株活性較強(qiáng);31 株菌具有蛋白酶活性,78%的菌株活性較強(qiáng);23 株菌具有較強(qiáng)的纖維素酶活性,83%的菌株活性較強(qiáng);具有脂肪酶活性的菌株較少,僅為12 株,67%的菌株活性較強(qiáng)。同時,研究發(fā)現(xiàn),59 株菌具有2 種或以上的功能酶產(chǎn)生能力。

以上結(jié)果說明,庫車小白杏果實(shí)中的內(nèi)生菌種類多樣,且存在大量具有豐富功能酶產(chǎn)生菌。

3 討 論

內(nèi)生細(xì)菌種類繁多,分布廣泛,且能通過多種途徑參與植物的代謝、發(fā)育和成熟,是寶貴的微生物資源,也是天然活性物質(zhì)的重要來源,但在現(xiàn)有條件下絕大多數(shù)還不能被培養(yǎng)出來[12]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,由于其方便、快捷、高效和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢,充分彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的不足,更為全面地展現(xiàn)了環(huán)境生態(tài)微生物的組成和分布,己成為環(huán)境微生物研究的重要手段[13]。然而,2012年法國的Didier Raoult團(tuán)隊(duì)首次提出了“微生物培養(yǎng)組學(xué)”的概念,并通過“微生物培養(yǎng)組學(xué)”獲得了大量此前高通量測序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)的微生物,有效的糾正了相關(guān)實(shí)驗(yàn)偏差[14-16]。2015年,Forster等[17]利用高通量測序法結(jié)合微生物潛在培養(yǎng)表型等多手段,分離獲得了大量“不可培養(yǎng)”腸道微生物;此外,相關(guān)研究也通過該法獲得了40多個潛在新種,20 多個潛在新屬,2 個潛在新科,展現(xiàn)了出了微生物培養(yǎng)組學(xué)的強(qiáng)大優(yōu)勢[18-19]。因此,開展高通量測序和有效的微生物培養(yǎng)分離,可更為全面地獲得樣本的群落組成。

本研究以庫車小白杏為研究對象,利用高通量測序法結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法,對庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析。高通量測序結(jié)果顯示,庫車小白杏采后內(nèi)生細(xì)菌共包括406 個OTU,涉及9 個門,94 個屬。在種群多樣性方面,未分類菌群OTU所占比例最高,占總菌群OTU的17.27%,其次為擬桿菌屬(Bacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等類群。通過可培養(yǎng)篩選共獲得99 株菌,歸類為4 個門28 個屬,研究還獲得了一批潛在的微生物新種,共涉及節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的5 個種,其中類芽孢桿菌屬的潛在新種最多。雖然,在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的微生物僅是其中一小部分,絕大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌都難以在現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)和條件下進(jìn)行繁殖和生長,但本實(shí)驗(yàn)通過可培養(yǎng)法獲得一批未在高通量測序結(jié)果中檢出的類群,分別為果糖桿菌屬(Fructobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、原小單胞菌屬(Promicromonospora)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)和類香味菌屬(Myroides)。表明了庫車小白杏果實(shí)中存在著寶貴的微生物資源,有待進(jìn)一步分析和挖掘。

研究進(jìn)一步對所得菌株的產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等能力進(jìn)行研究,為進(jìn)一步揭示活性酶產(chǎn)生菌與果實(shí)軟腐的潛在關(guān)系提供了科學(xué)材料。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)獲得的菌株中存在著豐富多樣的功能酶產(chǎn)生菌。具有淀粉酶活性的代表菌株的數(shù)量占絕大多數(shù),其次為果膠酶、蛋白酶、纖維素酶類菌株,而具有脂肪酶活性的菌株的數(shù)量最少。其中,69 株菌具有較強(qiáng)的淀粉酶活性,35 株菌具有果膠酶活性,23 株菌具有較強(qiáng)的纖維素酶活性,12 株菌具有脂肪酶活性,且59 株菌具有2 種或以上的功能酶產(chǎn)生能力。一般認(rèn)為,相關(guān)酶系的作用,在果實(shí)成熟和軟化中起著重要的作用。其中,淀粉在未成熟果實(shí)中的含量較多,隨著果實(shí)的成熟,其在酶的作用下其可轉(zhuǎn)化為糖,以葡萄糖和蔗糖為主。而葡萄糖可被大部分微生物所利用,且與真菌相比,細(xì)菌生長繁殖的速度較快[20-22];同時,果膠酶、纖維素酶等活性增強(qiáng)能夠引起小白杏果硬度的下降,是小白杏果實(shí)軟化的重要標(biāo)志[23-25]。盡管目前仍無法證明,內(nèi)生細(xì)菌在庫車小白杏成熟過程中代謝產(chǎn)酶的情況,但大量能產(chǎn)生相關(guān)酶的菌株存在,可推斷內(nèi)生細(xì)菌可通過利用杏果中的營養(yǎng)物質(zhì)大量生長和繁殖,同時部分內(nèi)生細(xì)菌可通過產(chǎn)生淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶等,推進(jìn)果實(shí)的成熟,加快果實(shí)軟化的速度,這可能是造成小白杏先出現(xiàn)水漬狀病斑,后發(fā)生腐爛的重要因素。

同時,前期高通量測序結(jié)果顯示,青熟期和完熟期的庫車小白杏中均存在與植物軟腐相關(guān)的病原菌,如葡糖桿菌屬、泛菌屬、歐氏菌屬和布倫納氏屬等菌群,且隨著小白杏的成熟,其所占比例呈倍數(shù)增長,最高可增加416 倍。而本實(shí)驗(yàn)通過可培養(yǎng)篩選法,進(jìn)一步驗(yàn)證了庫車小白杏中存在葡糖桿菌屬、泛菌屬、果糖桿菌屬、明串珠菌屬、歐文氏菌屬等與果實(shí)軟腐相關(guān)的菌株,與前期研究結(jié)果一致。相關(guān)研究己證實(shí),葡糖桿菌屬是引起柑橘、草莓腐爛和霉變的主要細(xì)菌[26-28];泛菌屬和布倫納氏屬的部分菌株可導(dǎo)致番茄[29-30]、玉米[31]、草莓[32]等的軟腐病;歐氏菌屬是引發(fā)丹尼斯鳳梨、大白菜等軟腐病的重要因素[33-34]。因此,以上與軟腐相關(guān)菌群的大量繁殖能否引起其他品種杏的軟腐變質(zhì),相關(guān)驗(yàn)證工作己開展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅揭示了庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌群落豐富的結(jié)構(gòu)組成及多樣性,證實(shí)了杏果中存在大量具有豐富功能的微生物資源;也從內(nèi)生細(xì)菌角度,為小白杏采后腐敗變質(zhì)內(nèi)在機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù),為其貯藏保鮮提供了新思路。