基于多元統(tǒng)計(jì)方法分析陳釀條件對浙江玫瑰醋香氣成分的影響

穆曉靜,方冠宇,蔣予箭

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310018)

陳釀是食醋色澤、香氣、體態(tài)形成的重要環(huán)節(jié),近年來對食醋、酒類等發(fā)酵性食品陳釀的研究多集中在人工催陳技術(shù)上,包括臭氧催陳[1]、微波催陳[2]、紅外線催陳[3]、超聲波催陳[4]、超高壓催陳[5]等,由于這些人工催陳技術(shù)存在一定弊端,還沒有一種高效、安全、穩(wěn)定、低成本的技術(shù)應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)中,自然陳釀仍在沿用。溫度是影響自然陳釀的一個(gè)重要因素,高本杰[6]研究了溫度對高純度白酒后熟過程風(fēng)味的影響,結(jié)果表明適當(dāng)增加溫度可加快白酒的老熟;王程成[7]研究表明溫度對風(fēng)味物質(zhì)葫蘆巴內(nèi)酯在黃酒陳釀過程中的形成起到了決定性的作用;黃文韜[8]將山西老陳醋新醋分別在低溫和高溫下陳釀,結(jié)果表明高溫條件下,酯化反應(yīng)、氧化反應(yīng)和羰氨反應(yīng)均較快,有利于后熟。

浙江玫瑰醋因其色澤鮮亮透徹,酸味柔和協(xié)調(diào),酸中帶甜成為食醋中的上乘佳品[9-10]。過去受氣候的影響和發(fā)酵設(shè)備的限制,浙江玫瑰醋的生產(chǎn)形成了春投料、夏發(fā)花、秋發(fā)酵、冬陳釀的固定模式,陳釀過程多在冬季進(jìn)行且占地面積大,陳釀周期長導(dǎo)致資金周轉(zhuǎn)慢。近幾年隨著發(fā)酵設(shè)備改進(jìn)[11],玫瑰醋實(shí)現(xiàn)了一年多次生產(chǎn),發(fā)酵結(jié)束后需要幾個(gè)月甚至1～3 a的陳釀方可食用。目前有關(guān)陳釀條件對玫瑰醋陳釀過程中風(fēng)味物質(zhì)的影響研究較少,實(shí)際生產(chǎn)中對陳釀效果的判斷多以經(jīng)驗(yàn)為主。

陳釀溫度和陳釀時(shí)間是影響陳釀過程中玫瑰醋香氣成分變化的2 個(gè)重要因素,香氣成分是衡量浙江玫瑰醋質(zhì)量的重要指標(biāo),本研究就現(xiàn)有的自然陳釀技術(shù),采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技術(shù)對不同溫度和時(shí)間下陳釀的浙江玫瑰醋中揮發(fā)性成分進(jìn)行測定,再結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法對測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,將溫度、陳釀時(shí)間對玫瑰醋中風(fēng)味物質(zhì)的影響用科學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋分析,以期為工業(yè)生產(chǎn)中玫瑰醋的陳釀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

浙江玫瑰醋醋樣:鮮醋(未經(jīng)陳釀)分別由紹興至味食品有限公司、湖州老恒和釀造有限公司、新昌縣天姥食品有限公司、浙江五味和食品有限公司提供,醋樣均為浙江玫瑰醋原釀汁,陳釀前總酸均為6.8 g/100 mL,實(shí)驗(yàn)室里完成貯藏,樣品具體信息見表1。

2-乙基丁酸(色譜純) 廣州市江順化工科技有限公司;無水乙醇(分析純) 無錫市展望化工試劑有限公司;NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol/L)(分析純) 西隴科學(xué)股份有限公司。

表1 醋樣信息Table 1 Detailed information about vinegar samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-215DK恒溫培養(yǎng)箱 青島海爾股份有限公司;SPX-250B-Z冰箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DVB/CAR/PDMS萃取頭(50/30 μm) 美國Supelco公司;7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME條件

取樣品12.5 mL置于20 mL頂空瓶中(檢測前將樣品放4 ℃冰箱中使樣品溫度一致),再加100 μL內(nèi)標(biāo)物(2-乙基丁酸),用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡30 min,然后將己在240 ℃進(jìn)樣口老化至無雜峰的萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處,50 ℃吸附30 min,取出后插入GC進(jìn)樣口,240 ℃解吸2 min,進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 GC條件

色譜柱:DB-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm,0.5 μm);進(jìn)樣口溫度:240 ℃,不分流進(jìn)樣,恒流模式,柱流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃保持3 min,以3 ℃/min升到220 ℃,保持10 min。

1.3.3 MS條件

離子源:電子電離源;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;質(zhì)量掃描范圍:33～500 u;質(zhì)譜譜庫檢索使用NIST 14數(shù)據(jù)庫。

1.3.4 樣品香氣成分半定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行半定量分析,以159.18 mg/L 2-乙基丁酸(用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液配制)為內(nèi)標(biāo)物[12]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Origin 9和Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì),IBM SPSS Statistics 22比較香氣揮發(fā)物之間的差異性,結(jié)果表示為,P＜0.05,差異顯著;用SIMCA 14.2軟件進(jìn)行PCA,在PCA的基礎(chǔ)上,根據(jù)樣品的聚類趨勢,對樣品人為歸類后進(jìn)行OPLS-DA,并繪制PCA得分圖、HotellingT2分布圖、OPLS-DA得分圖和模型置換驗(yàn)證圖、S-plot圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同陳釀條件下醋樣香氣成分組成及質(zhì)量濃度比較

香氣是衡量浙江玫瑰醋品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo),然而剛釀造好的新鮮玫瑰醋口感生硬,酸味刺激,雜味較濃,香氣單薄,不宜食用,因此要經(jīng)過陳釀環(huán)節(jié),增加食醋風(fēng)味物質(zhì)使其香氣協(xié)調(diào)。本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS技術(shù)對不同條件下陳釀的16 種醋樣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測,所得GC-MS檢測結(jié)果通過計(jì)算機(jī)NIST 14譜庫和人工檢索處理,選出匹配度不小于80%的化合物并參考文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果見表2。

表2 不同陳釀條件下浙江玫瑰醋中揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度Table 2 Volatile components in Zhejiang rosy vinegar under different aging conditions μg/L

續(xù)表2 μg/L

續(xù)表2 μg/L

圖1 醋樣在不同陳釀條件下的各類揮發(fā)性成分總量比較Fig. 1 Comparison of the total content of each class of volatiles in rosy vinegar samples under different aging conditions

每個(gè)醋樣中質(zhì)量濃度最高的醇類均為苯乙醇,這種物質(zhì)具有清淡玫瑰花香,目前被鑒定為酒中重要的芳香族化合物[15],也是玫瑰醋中貢獻(xiàn)率較大的一種醇類物質(zhì),其次為乙醇和異戊醇。由圖1可以看出,高溫陳釀5 個(gè)月、常溫陳釀2.5 a比低溫、常溫陳釀5 個(gè)月的醋樣醇類總質(zhì)量濃度顯著降低(P＜0.05),劉源等[16]研究表明,在陳釀過程中醇類被氧化為醛、酸,以及與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng),使醇類質(zhì)量濃度降低,尤其是乙醇質(zhì)量濃度。乙醇質(zhì)量濃度的降低使食醋的口感變得綿軟柔和[17]。本研究表明溫度越高,醇類物質(zhì)下降越明顯。

每個(gè)醋樣中檢測出7 種酸類化合物,除了主體乙酸外,質(zhì)量濃度較高的為異丁酸、異戊酸和辛酸,其中異丁酸具有牛奶香、酸味香、水果香和脂肪香的組合香氣,賦予浙江玫瑰醋較好風(fēng)味[18]。由表2和圖1可以看出,陳釀溫度和時(shí)間對玫瑰醋中異丁酸質(zhì)量濃度影響不顯著(P＞0.05),對乙酸影響顯著(P＜0.05)。陳釀溫度越高,時(shí)間越久,乙酸質(zhì)量濃度越低,總酸質(zhì)量濃度也越少,該結(jié)果與黃文韜[8]研究結(jié)果一致。說明醋經(jīng)陳釀后,伴隨著酯化反應(yīng)和揮發(fā)酸的揮發(fā),總酸質(zhì)量濃度降低,但剩余的不易揮發(fā)酸使食醋酸味更加柔和,高溫更有利于反應(yīng)的進(jìn)行。

酯類物質(zhì)是醋樣中檢測到的種類最多、質(zhì)量濃度最高的風(fēng)味物質(zhì)。質(zhì)量濃度較高的酯類有乙酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、乙酸異戊酯、二乙基丙二酸乙酯。陳釀過程中酯類的形成途徑主要是在酯酶的催化下由酸類物質(zhì)與相應(yīng)的醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng),或是乙酰輔酶A在醇酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下和相應(yīng)的醇類縮合而成[19-20],絕大多數(shù)的酯類具有花香、果香和蜂蜜香,是大多數(shù)食醋風(fēng)味的重要來源。由圖1可知,高溫5 個(gè)月陳釀醋中酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度比低溫和常溫陳釀相同時(shí)間的醋顯著降低(P＜0.05),常溫2.5 a陳釀醋中酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度略有下降,該結(jié)果說明溫度對玫瑰醋中酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度影響較大,溫度越高,酯類物質(zhì)減少量越大。

醛、酮、酚及其他物質(zhì)在醋樣中檢測到質(zhì)量濃度及種類較少,酚類最少,但酚類物質(zhì)的氣味閾值較低,構(gòu)成玫瑰醋特有的香氣[21-22]。苗志偉等[23]研究表明,糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁二酮等物質(zhì)對山西老陳醋特征香氣起重要作用,這些物質(zhì)多在陳釀過程中產(chǎn)生。由表2看出,高溫5 個(gè)月陳釀醋和常溫2.5 a陳釀醋中這些物質(zhì)質(zhì)量濃度顯著增加(P＜0.05),其中糠醛主要來自于美拉德反應(yīng)和酸催化條件下的糖降解反應(yīng),是食品中褐色的主要來源[24],影響著玫瑰醋的色澤。該結(jié)果表明高溫陳釀更有利于糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁二酮等物質(zhì)的形成,為玫瑰醋提供特殊風(fēng)味。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 基于PCA對不同陳釀條件下玫瑰醋的區(qū)分

近些年,隨著多元統(tǒng)計(jì)分析方法的推廣,越來越多的統(tǒng)計(jì)分析方法應(yīng)用于同一物質(zhì)不同品種間的化學(xué)識別[25-26]、香氣指紋圖譜的建立[27-28]、特征性香氣成分分析[29]等方面的研究。其中PCA可大大降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜度,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理[30]。由于本實(shí)驗(yàn)所測樣品的風(fēng)味物質(zhì)復(fù)雜且樣品量較多,通過PCA可從數(shù)據(jù)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系中找到一些主成分,從而有效利用大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,因此采用PCA對測定結(jié)果進(jìn)行分析,提取4 個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率為64.26%,基本可以反映整體樣本信息。

圖2 PCA得分圖（a）和Hotelling T2分布圖（b）Fig. 2 PCA score plot (a) and Hotelling T2 value range plot (b)

由圖2a可以看出,16 種醋樣呈現(xiàn)極明顯的區(qū)域分布特性,被分為4 類:A類醋樣(#1、#2、#3、#4)均為0～5 ℃低溫下陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋;B類醋樣(#5、#6、#7、#8)均為常溫下陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋;C類醋樣(#9、#10、#11、#12)均為高溫下陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋;D類醋樣(#13、#14、#15、#16)均為常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋。說明不同陳釀條件下的玫瑰醋風(fēng)味物質(zhì)有明顯差異,但由于PCA是無監(jiān)督分析模型,不能去除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響,從而使部分不同條件下陳釀的玫瑰醋(如#12、#13)區(qū)分不明顯,但由圖2b可看出,所有樣品均在95% Hotelling T2置信區(qū)間內(nèi),未發(fā)現(xiàn)超出該置信區(qū)間的樣本,可進(jìn)一步對樣品中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行OPLS-DA。

2.2.2 基于OPLS-DA對不同陳釀條件下玫瑰醋的區(qū)分

圖3 OPLS-DA得分圖（a）和OPLS-DA模型置換驗(yàn)證圖（b）Fig. 3 Score plot of OPLS-DA (a) and permutation test plot (b)

OPLS-DA是在PCA基礎(chǔ)上再進(jìn)行計(jì)算分析的一種方法,但相比于PCA,OPLS-DA屬于有監(jiān)督分析,可通過預(yù)設(shè)分類,盡可能去除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響,可進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)信息,同時(shí)可以量化特征風(fēng)味物質(zhì)造成樣品之間差異的程度[31-32]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)PCA的聚類趨勢,將同一條件下陳釀醋作為Y變量進(jìn)行OPLS-DA。

由圖3a可看出,分別在低溫和常溫下陳釀5 個(gè)月的醋樣(A類和B類)極其靠近,但是這2 類醋樣遠(yuǎn)離常溫陳釀2.5 a的D類醋,說明D類醋與A、B類成分相差較大;而在高溫下陳釀5 個(gè)月的C類醋與D類醋靠近,表明在高溫下短時(shí)間陳釀的玫瑰醋成分較接近常溫下長時(shí)間陳釀的玫瑰醋。為驗(yàn)證該OPLS-DA模型的可靠性,對樣本順序進(jìn)行隨機(jī)置換,將建立OPLA-DA模型時(shí)定義分類Y的變量順序隨機(jī)排列200 次,得到的Q2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)[33]。如圖3b所示,R2和Q2回歸線的斜率均大于1,且Q2回歸線的截距小于0,結(jié)果表明該OPLS-DA模型可靠,未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象,可用于對實(shí)驗(yàn)中的16 種玫瑰醋樣判別分析。因此用該模型進(jìn)一步對不同玫瑰醋醋樣中重要香氣成分進(jìn)行分析。

2.2.3 不同陳釀條件下玫瑰醋中重要香氣成分差異分析

圖4 OPLS-DA S-plot圖Fig. 4 S-plot of OPLS-DA

為可視化OPLS-DA模型中的變量,分析造成2 類樣品存在差異的標(biāo)志性物質(zhì),S-plot圖可得到變量投影重要性[34]。根據(jù)2 類存在差異的樣品中揮發(fā)性物質(zhì)含量數(shù)據(jù),通過SIMCA軟件做出S-plot圖。為分析不同陳釀年份的玫瑰醋中重要香氣成分差異,將B類醋與D類醋進(jìn)行對比,S-plot見圖4a。為分析不同陳釀溫度對玫瑰醋中重要香氣成分的影響,進(jìn)一步對不同陳釀溫度下的玫瑰醋進(jìn)行對比,由于A類醋和B類醋樣差異極小,因此只選擇其中之一A類醋與C類醋進(jìn)行對比,S-plot圖見圖4b。

OPLS-DA S-plot圖S形左下方和右上方2 個(gè)角上的變量是區(qū)分兩組樣品的主要風(fēng)味物質(zhì)。由圖4a得出,D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、E5(3-羥基-2-丁酮)、C1(乙酸乙酯)、A3(苯乙醇)、E6(3-乙?；?2-丁酮)等是造成B類和D類醋樣呈現(xiàn)差異的主要物質(zhì);玫瑰醋陳釀過程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇、3-乙酰基-2-丁酮等物質(zhì)含量變化較大。

由圖4b看出,C1(乙酸乙酯)、E8(2,3-丁二酮)、E6(3-乙?；?2-丁酮)、D8(糠醛)是造成A類與C類醋差異顯著的主要風(fēng)味物質(zhì),說明玫瑰醋陳釀過程中溫度對這幾種物質(zhì)影響較大。

為對每種陳釀條件的浙江玫瑰醋中重要香氣成分分析,做出OPLS-DA因子荷載圖,可反映每一個(gè)變量在得分圖上的貢獻(xiàn)。

圖5 OPLS-DA因子荷載圖Fig. 5 Loading factors plot of OPLS-DA

從圖5可以看出,E3(4-甲基-2-戊酮)、C19(2-甲基巴豆酸異戊酯)、C11(2-乙基丁酸-2甲基丙基酯)、A1(乙醇)、C1(乙酸乙酯)等物質(zhì)是低溫后熟玫瑰醋(#1、#2、#3、#4)和常溫后熟玫瑰醋(#5、#6、#7、#8)中的特征性風(fēng)味物質(zhì);C16(3-乙氧基乙酸丙酯)、C18(2-乙基丁酸-庚-4-基酯)、C30(2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯)、C37(鄰苯二甲酸二庚酯)等是高溫后熟玫瑰醋的重要香氣物質(zhì),常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋(#13、#14、#15、#16)主要香氣成分是C26(乙酸苯甲酯)、F2(2,4-二叔丁基苯酚)、D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、B2(異丁酸)、D10(2-羥基苯甲醛)等風(fēng)味物質(zhì)。

綜上所述,溫度對玫瑰醋的陳釀后熟影響較大,冷藏后熟的玫瑰醋和常溫后熟的風(fēng)味接近,但與高溫下陳釀相同時(shí)間的玫瑰醋風(fēng)味差異較大,高溫陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋風(fēng)味接近常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋,說明高溫下玫瑰醋中的物質(zhì)發(fā)生各類化學(xué)反應(yīng)較快,更有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成,因此可推斷高溫陳釀對浙江玫瑰醋有催陳作用。

3 結(jié) 論

采用SPME-GC-MS技術(shù)對不同陳釀條件下的浙江玫瑰醋中揮發(fā)性成分醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、酚類進(jìn)行定性半定量檢測,結(jié)果表明,高溫(35～40 ℃)陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋和常溫下陳釀2.5 a的玫瑰醋中醇類、酸類、酯類等均顯著低于低溫(0～5 ℃)、常溫(20～25 ℃)陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋,但酮類、醛類總含量普遍偏高,其中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物糠醛明顯增多。

對數(shù)據(jù)進(jìn)一步采用PCA、OPLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果看出PCA、OPLS-DA均可對不同陳釀條件的浙江玫瑰醋進(jìn)行有效區(qū)分,其中高溫陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋和常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋靠得較近,低溫陳釀5 個(gè)月和常溫陳釀5 個(gè)月的玫瑰醋靠得近,說明高溫陳釀可縮短陳釀周期。

通過OPLS-DA S-plot圖得出:1)玫瑰醋陳釀過程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇等物質(zhì)含量變化較大;2)玫瑰醋陳釀過程中溫度對乙酸乙酯、苯甲醛、2,3-丁二酮、糠醛等物質(zhì)影響較大。

OPLS-DA荷載圖得出:4-甲基-2-戊酮、2-甲基巴豆酸異戊酯、2-乙基丁酸-2甲基丙基酯、乙醇、乙酸乙酯等物質(zhì)是低溫陳釀玫瑰醋和常溫陳釀玫瑰醋中的特征性風(fēng)味物質(zhì);3-乙氧基乙酸丙酯、2-乙基丁酸-庚-4-基酯、2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯、鄰苯二甲酸二庚酯等是高溫陳釀組玫瑰醋的主要呈味物質(zhì),常溫陳釀2.5 a的玫瑰醋主要呈味物質(zhì)是乙酸苯甲酯、2,4-二叔丁基苯酚、糠醛、2,3-丁二酮、異丁酸、2-羥基苯甲醛等風(fēng)味物質(zhì)。