劉 均，沈佳敏，沈建良，劉雅麗

(1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江 杭州310016； 2.浙江卓旺農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 湖州 313000； 3.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測總站，浙江 杭州 310020)

冷鮮禽的貯藏溫度一般控制在0～4 ℃，因在生產(chǎn)中經(jīng)過了熟化，質(zhì)地柔軟富有彈性、口感較嫩深受消費者喜愛，另外發(fā)展冷鮮禽隔斷了人與活禽的直接接觸，降低了禽流感類疫病感染的風險，受到政府部門的重視與推行。雖然低溫限制了微生物繁殖，但禽肉營養(yǎng)豐盛仍能較快腐敗，嚴重地影響了冷鮮禽業(yè)發(fā)展，因而冷鮮禽防腐保鮮研究十分迫切?，F(xiàn)有研究表明，微生物是引起腐敗的主要原因，其中初始菌數(shù)越多貨架期越短[1-2]。目前，主要是采用在冷鮮禽加工水冷環(huán)節(jié)使用抑菌類物質(zhì)消毒[3-4]，對冷卻后的胴體使用輻射干預(yù)[5]、天然保鮮劑浸泡或者涂抹處理[6-7]、降低貯藏溫度[8]等方法處理以延長貨架期。另外，對冷鮮禽進行包裝銷售，尤其是真空包裝、氣調(diào)包裝等包裝技術(shù)的改進對延長保質(zhì)期作用顯著[9-10]。研究不同包裝形式下冷鮮禽貨架期微生物的菌相變化規(guī)律，對于改善和提高冷鮮禽加工工藝具有重要意義。因此，本研究結(jié)合冷鮮禽加工工藝，待冷鮮雞胴體的中心溫度水冷降至7 ℃以下時，以無包裝為對照，以托盤包裝(模擬超市銷售)和真空包裝為實驗組，研究不同包裝方式下冷鮮雞貨架期微生物菌相的演替規(guī)律，為豐富和完善冷鮮禽業(yè)生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗采用60只同一批、體質(zhì)量無顯著差異的120日齡黃羽肉雞，由浙江卓旺農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。托盤和真空包裝袋均購自當?shù)爻小?/p>

1.2 實驗方法

選取體質(zhì)量相近的黃羽肉雞60只，經(jīng)宰前檢疫合格后進入屠宰流水線，分別先后經(jīng)過掛鉤電暈—割頸放血—高溫噴淋—浸燙脫毛—脫爪取內(nèi)臟—胴體水冷降溫，待胴體中心溫度降至7 ℃以下時，隨機收集黃羽肉雞胴體60只，隨機分成3組，每組20只，分別采用無包裝(PK1)、托盤包裝(PK2)和真空包裝(PK3)的方式處理。包裝結(jié)束后置于同一臺0～4 ℃冷柜冷藏，并分別于第1、3、5、7天抽樣檢測微生物指標變化，每次每組抽樣3只。

1.3 檢測方法

微生物定性定量：在各個檢測時間點上，每組隨機抽取3只胸肌肉樣本，提取DNA后經(jīng)過質(zhì)檢和純化，再利用16S特異性PCR檢測引物進行特異性擴增，獲得PCR產(chǎn)物后，利用Illumina公司的MiSeq測序儀產(chǎn)生2×300 bp的測序，然后進行OTU(operational taxonomic units)分析。以97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，每一個OTU通常被視為一個微生物物種。相似性小于97%就可以認為屬于不同的種；相似性為93%～95%，可以認為屬于不同的屬。樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度都是基于對OTU的分析，并最終進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞種水平優(yōu)勢菌群變化

經(jīng)16S rDNA測序分析，有超過500種(species)細菌被鑒定出來，圖1中列出的是在不同包裝方式、不同時間點下冷鮮雞菌群種相對豐度最高的前20種細菌，其中前10分別為嗜冷桿菌屬亞種(Psychrobactersanguinis)、糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)、沃式不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)、棲海沙嗜冷桿菌(Psychrobacterarenosus)、鹽晶嗜冷桿菌(Psychrobactercryohalolentis)、奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)、產(chǎn)氮假單胞菌(Pseudomonasazotoformans)、棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、速生嗜冷桿菌(Psychrobacterceler)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)。

隨著貯藏時間的增加，PK1、PK2和PK3組中種水平上其他菌(Others)所占比例不斷降低，表示豐度最高的前20種優(yōu)勢菌存在優(yōu)勢繁殖，所占豐度不斷增加。另外，在相同貯藏時間下，PK1組前20種優(yōu)勢細菌豐度占比量明顯高于PK2組和PK3組。PK1、PK2和PK3組中豐度占比最高的兩種菌均為嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌，均隨著貯藏時間而不斷增加，且以PK1組增加最為明顯，其次為PK3組，最后PK2組，具體表現(xiàn)為：相較于第1天，第7天時PK1組嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌分別增加了18.01百分點、4.66百分點；PK2組分別增加了4.39百分點、2.35百分點；PK3組分別增加了5.63百分點、3.46百分點。

沃式不動桿菌：相較于貯藏第1天，第7天時，PK1組從1.51%增加至1.86%，增加了0.35百分點；PK2組從2.05%下降至1.22%，降低了0.83百分點；PK3組從1.22%增加至2.11%，增加了0.89百分點。奧斯陸莫拉菌：PK1、PK2和PK3組中隨著貯藏時間而不斷下降，分別降低了0.57百分點、0.44百分點和0.17百分點。大腸埃希菌：PK2組和PK3組豐度隨著貯藏時間而不斷降低，但PK1組則相反，呈不斷增長。PK1組大腸埃希菌增加了0.38百分比；PK2組和PK3組分別降低了0.10百分點和0.36百分點。

2.2 冷鮮雞科水平優(yōu)勢菌群變化

圖 2顯示的是在整個貯藏過程中菌群相對豐度占比最高的前20個科，其中前10分別為：氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、unidentified_Chloroplast、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和假交替單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)。

雖然包裝方式不同，但科水平相對豐度占比最高的均為氣單胞菌科和莫拉氏菌科，而且在相同貯藏時間下PK2組和PK3組的氣單胞菌科和莫拉氏菌科相對豐度之和分別為74.27%～77.07%和68.81%～84.07%，明顯高于PK1組(33.51%～66.26%)?？扑缴掀渌?Others)所占豐度隨貯藏時間不斷降低，PK1組由第1天的29.91%下降至第7天的12.46%，降低了17.45百分點，PK3組從9.63%下降至6.81%，降低了2.82百分點，PK2組從10.97%下降至10.69%，降低了0.28百分點。

從圖 2中可以看出，貯藏過程中莫拉氏菌科、假單胞菌科和鏈球菌科相對豐度不斷增加，具體表現(xiàn)為：PK1組、PK2組和PK3組莫拉氏菌科分別增加了19.19百分點、3.77百分點和28.11百分點；假單胞菌科分別增加了7.37百分點、1.43百分點和1.66百分點；鏈球菌科分別增加了0.75百分點、1.24百分點和3.04百分點。另外，貯藏過程中乳桿菌科、毛螺菌科和假交替單胞菌科均存在不同程度降低，具體表現(xiàn)為：PK1組、PK2組和PK3組乳桿菌科分別降低了2.10百分點、1.34百分點和1.44百分點；毛螺菌科分別降低了0.71百分點、0.41百分點和0.72百分點；假交替單胞菌科分別降低了1.74百分點、0.01百分點和0.01百分點。還有，PK1組氣單胞菌科增加了6.80百分點，PK2組和PK3組則分別降低了3.08百分點和23.61百分點。腸桿菌科和黃單胞菌科均存在不同程度降低，PK1組和PK3組腸桿菌科分別降低了2.22百分點和1.65百分點，黃單胞菌科分別降低了1.94百分點和0.27百分點，但是PK2組變化較小。

2.3 冷鮮雞門水平優(yōu)勢菌群變化

圖3顯示的是冷鮮雞貯藏中相對豐度占比最高的前10個門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)。PK1組變形菌門和厚壁菌門相對豐度之和隨著貯藏時間的增加而不斷增加，從第1天的69.77%增加至第7天的90.62%，增加了20.85百分點；PK2組和PK3組變形菌門和厚壁菌門相對豐度之和均在90%以上。

圖3 不同包裝方式對冷鮮雞菌群門水平差異變化的影響Fig.3 Effects of different storage methods on the changes of dominant bacteria at phylum levels of chilled chicken

結(jié)合圖1和圖2，不同包裝方式下相對豐度占比最高的嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌，以及相對豐度占比前10的沃式不動桿菌、奧斯陸莫拉菌，均同屬于莫拉氏菌科，同屬于變形菌門。另外，PK1組貯藏過程中相對豐度不斷增加的大腸埃希菌，屬于腸桿菌科，但同樣屬于變形菌門。因此，研究表明，在低溫(0～4 ℃)貯藏過程中嗜冷菌(嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌)得到了優(yōu)勢化增殖，主要是屬于莫拉氏菌科和變形菌門。

圖2 不同包裝方式對冷鮮雞菌群科水平差異變化的影響Fig.2 Effects of different storage methods on the changes of dominant bacteria at family levels of chilled chicken

PK1.1、PK1.3、PK1.5、PK1.7分別表示PK1組貯藏第1、3、5、7天；PK2.1、PK2.3、PK2.5、PK2.7分別表示PK2組貯藏第1、3、5、7天；PK3.1、PK3.3、PK3.5、PK3.7分別表示PK3組貯藏第1、3、5、7天。PK1.1, PK1.3, PK1.5, PK1.7 represented the first, third, fifth and seventh day of storage in PK1 group, respectively; PK2.1, PK2.3, PK2.5, PK2.7 represented the first, third, fifth and seventh day of storage in PK2 group, respectively; PK3.1, PK3.3, PK3.5, PK3.7 represented the first, third, fifth and seventh day of storage in PK3 group, respectively.圖1 不同包裝方式對冷鮮雞菌群種水平差異變化的影響Fig.1 Effects of different storage methods on the changes of dominant bacteria at species levels of chilled chicken

相較于無包裝來說，托盤包裝和真空包裝有利于抑制大腸埃希菌等有害菌的生長，均明顯抑制了占比量最高的兩大嗜冷菌(嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌)的繁殖速度，有助于延緩低溫腐敗。

3 討論

邵偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏過程中假單胞菌是冷鮮肉低溫貯藏中的優(yōu)勢菌群，它屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)和變形菌門(Proteabacteria)，是一種腐敗能力較強的細菌[12]。本研究在無包裝、托盤包裝和真空包裝下貯藏7 d，相較于第1天時假單胞菌科分別增加了7.37百分點、1.43百分點、1.66百分點，相較于無包裝組的增長幅度，托盤包裝和真空包裝下增長速度明顯降低，表明托盤包裝和真空包裝在一定程度上可以抑制假單胞菌的增殖腐敗。呼紅梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在熱縮真空包裝下，貯藏后期冷卻豬肉中主要以肉食桿菌(Carnobacterium，肉桿菌科，厚壁菌門)、乳桿菌(Lactobacillus，乳桿菌科，厚壁菌門)和乳球菌(Lactococcus，鏈球菌科，厚壁菌門)等優(yōu)勢腐敗菌為主。本研究揭示，乳桿菌科和鏈球菌科是引起冷鮮雞腐敗的優(yōu)勢菌，尤其是貯藏末期的優(yōu)勢菌群，在無包裝、托盤包裝和真空包裝下貯藏7 d，相較于第1天鏈球菌科分別增加了0.75百分點、1.24百分點和3.04百分點，乳桿菌科相對豐度有所下降，分別降低了2.10百分點、1.34百分點和1.44百分點，但仍然是冷鮮雞貯藏腐敗的優(yōu)勢菌群，與呼紅梅等[13]的研究結(jié)果基本一致。高文靜[14]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)光桿菌(Photobacterium，弧菌科，變形菌門)、絲環(huán)菌(Brochothrix)、腸球菌(Enterococcus，腸桿菌科，厚壁菌門)、假單胞菌(Pseudomonas，假單胞菌科，變形菌門)、不動桿菌(Acinetobacter，莫拉氏菌科，變形菌門)、莫拉氏菌(Moraxella，莫拉氏菌科，變形菌門)、弧菌(vibrio，弧菌科，變形菌門)、氣單胞菌(Aeromonas，氣單胞菌科，變形菌門)、紫色桿菌(Chromobacterium，奈瑟氏菌科，變形菌門)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia，伯克氏菌科，變形菌門)等菌是引起冷卻肉腐敗的優(yōu)勢腐敗菌。雖然在細菌種分類水平上的具體優(yōu)勢菌群與本次實驗結(jié)果略有不同，但從中也可以看出這些優(yōu)勢菌群大都同屬于腸桿菌科、假單胞菌科、氣單胞菌科、莫拉氏菌科等，以及大都屬于變形菌門，與本實驗結(jié)果也較為一致。因而，控制嗜冷桿菌屬亞種、糞嗜冷桿菌、沃式不動桿菌、棲海沙嗜冷桿菌、鹽晶嗜冷桿菌、奧斯陸莫拉菌、產(chǎn)氮假單胞菌、棉子糖乳球菌、速生嗜冷桿菌和大腸埃希菌等優(yōu)勢腐敗菌的繁殖，尤其是抑制嗜冷桿菌屬亞種和糞嗜冷桿菌的腐敗增殖對延長冷鮮禽貨架期至關(guān)重要，需要開展更深入的研究以切實有效延長貨架期。