李 月,李 想

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng)110032;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/遼寧省腫瘤醫(yī)院,遼寧 沈陽(yáng)110042)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少,引起心肌能量代謝不正常的一種病理狀態(tài)。流行病學(xué)研究顯示,與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的重要危險(xiǎn)因素為高脂血癥、高血壓等[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是指冠狀動(dòng)脈壁上沉積了一層脂類(lèi),從而使冠狀動(dòng)脈彈性降低、管腔變窄。其中氧化修飾的低密度脂蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此降低血脂、預(yù)防高脂血癥在防治動(dòng)脈粥樣硬化形成中起著重要作用[2]。復(fù)方山楂煎劑是由山楂、延胡索、丹參、菊花、紅花、麥芽組成,本研究主要觀察復(fù)方山楂煎劑對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌Caspase-1表達(dá)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)SD大鼠90只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司,合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 藥品和試劑 復(fù)方山楂煎劑由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥物制劑教研室提供;脂必妥片(成都地奧九泓制藥廠,生產(chǎn)批號(hào)：20170914);丙基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝輝藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)：20161208);豬油,市售;膽固醇(上海如吉生物科技發(fā)展公司,生產(chǎn)批號(hào)：20170622);膽酸鈉(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司,生產(chǎn)批號(hào)：F20170428)。丙二醛(MDA)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20170213B),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20170422),肌酸激酶(CK)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20170331),以上試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。維生素D3(青島雙鮮藥業(yè)有限公司),半胱天冬酶-1(Caspase-1)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),PBS磷酸緩沖鹽(北京索萊寶科技有限公司),TMS-P超敏試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),DAB顯色劑(福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 徠卡RM2235型切片機(jī)(德國(guó));Be LDHmanCX-7型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó));島津U-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本);BK-P型生物組織攤片機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);DB-B1型烤片機(jī)(北京金時(shí)速儀器設(shè)備經(jīng)營(yíng)部);HWS-100F型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海丙林電子科技有限公司);奧林巴斯BX43型光學(xué)顯微鏡(日本);PHS-3G型PH計(jì)(武漢天壹力儀器設(shè)備有限公司);JKDP2型電熱恒溫培養(yǎng)箱(廈門(mén)醫(yī)療電子儀器廠);JTS-3B型電子秤(廈門(mén)懿恒電子有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 按(15∶5∶10∶3.9∶1∶15)比例稱取山楂、延胡索、丹參、菊花、紅花、麥芽共4 990 g,將以上藥物置于不銹鋼煎煮鍋中,加水10 000 m L,浸泡30 min,煮沸后,文火煎煮30 min,倒出藥液,再加水10 000 m L,再次煎煮20 min,合并兩次煎液,再濃縮至840 m L。將藥液分裝7袋,每袋120 m L,4℃保存?zhèn)溆?每日取1袋用于灌胃給藥,每周制備1次,中劑量和低劑量藥液由高劑量藥液按1∶2和1∶4比例稀釋所得。

2.2 造模及給藥 購(gòu)入大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方山楂煎劑低劑量組(14.85 g生藥/kg)、復(fù)方山楂煎劑中劑量組(29.7 g生藥/kg)、復(fù)方山楂煎劑高劑量組(59.4 g生藥/kg)、脂必妥組(1.5 g/kg),空白對(duì)照組10只,其余各組每組16只,雌雄各半。空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃蒸餾水10 m L/kg,各給藥組灌胃相應(yīng)藥物,每日1次,給藥體積為10 m L/kg。造模與給藥同時(shí)進(jìn)行。空白對(duì)照組喂飼普通飼料,其余各組喂飼高脂飼料(膽固醇5%、豬油15%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.2%)[3],同時(shí)每2周灌服1次維生素D315萬(wàn)U/kg,實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、自由飲水,連續(xù)造模并給藥10周。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠于第5周皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1),隔日1次,共注射3次[4]。

2.3 油紅O脂肪染色法及評(píng)價(jià)方法[5]剪取主動(dòng)脈瓣骨髓動(dòng)脈分支處的胸腹主動(dòng)脈,并縱向剖開(kāi),10%甲醛固定,應(yīng)用油紅O脂肪染色法,觀察實(shí)測(cè)動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊的面積,將主動(dòng)脈內(nèi)膜動(dòng)脈粥樣硬化的程度分為5級(jí)。0級(jí)：內(nèi)膜表面光滑,無(wú)紅染;1級(jí)：內(nèi)膜有輕度紅染,但無(wú)突出表面的斑塊;2級(jí)：有明顯凸起紅染斑塊,面積＜0.5 mm2;3級(jí)：0.5 mm2≤斑塊面積≤1.5 mm2;4級(jí)：斑塊融合成片,大部分斑塊面積＞1.5 mm2;5級(jí)：斑塊幾乎覆蓋整個(gè)動(dòng)脈內(nèi)膜。

2.4 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10 min,滴加10%山羊血清封閉,滴加一抗(Caspase-1抗體稀釋比例為1∶350)[6],滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉素工作液,DAB顯色劑顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。免疫組化圖片采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析,抗體表達(dá)越強(qiáng),組織染色越深,灰度值越小。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 觀察指標(biāo) 末次灌胃給藥1 h后,各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 m L/kg。麻醉后腹主動(dòng)脈采血,分離血清,檢測(cè)MDA、GSH-Px、CK含量。取胸腹主動(dòng)脈,油紅O脂肪染色法檢測(cè)動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊的面積;取心臟左心室,采用免疫組化染色法檢測(cè)Caspase-1在心肌組織中的表達(dá)。

3.2 結(jié)果分析

(1)氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠血清MDA、CK含量升高,GSH-Px含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較,復(fù)方山楂煎劑低劑量組、中劑量組、高劑量組及脂必妥組大鼠血清MDA含量降低,GSH-Px含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)方山楂煎劑中劑量組、高劑量組及脂必妥組大鼠血清CK含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血液氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

表1 各組大鼠血液氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(±s)

注：與空白對(duì)照組比較,△P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) MDA(nmol/m L) CK(U/DL) GSH-Px(μ/m L)空白對(duì)照組 10 4.68±0.51 402.75±37.21 252.59±27.45模型對(duì)照組 16 12.11±1.47△ 665.16±59.16△ 136.18±12.75△復(fù)方山楂煎劑低劑量組 16 8.97±0.89▲ 608.47±54.13 180.14±15.31▲復(fù)方山楂煎劑中劑量組 16 7.24±0.59▲ 594.86±49.81▲ 196.57±18.84▲復(fù)方山楂煎劑高劑量組 16 5.97±0.63▲ 577.94±43.28▲ 225.71±24.41▲脂必妥組 16 9.09±0.97▲ 591.35±62.11▲ 175.34±19.49▲

(2)動(dòng)脈粥樣硬化積分比較 與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化積分升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較,復(fù)方山楂煎劑中劑量組、高劑量組、脂必妥組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化積分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化積分比較(分,±s)

表2 各組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化積分比較(分,±s)

注：與空白對(duì)照組比較,△P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) 動(dòng)脈粥樣硬化積分空白對(duì)照組 10 0模型對(duì)照組 16 2.43±0.81△復(fù)方山楂煎劑低劑量組 16 1.80±0.65復(fù)方山楂煎劑中劑量組 16 1.41±0.53▲復(fù)方山楂煎劑高劑量組 16 1.09±0.34▲脂必妥組 16 1.69±0.62▲

(3)心肌組織中Caspase-1表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠心肌組織中Caspase-1表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較,復(fù)方山楂煎劑中劑量組、高劑量組、脂必妥組大鼠心肌組織中Caspase-1表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織中Caspase-1表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠心肌組織中Caspase-1表達(dá)比較(±s)

注：與空白對(duì)照組比較,△P＜0.05;與模型對(duì)照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數(shù) Caspase-1空白對(duì)照組 10 201.57±19.36模型對(duì)照組 16 141.54±12.66△復(fù)方山楂煎劑低劑量組 16 153.13±15.18復(fù)方山楂煎劑中劑量組 16 168.55±17.48▲復(fù)方山楂煎劑高劑量組 16 175.19±21.67▲脂必妥組 16 171.93±19.47▲

4 討論

臨床中可引起心肌缺血的原因較多,其中常見(jiàn)的原因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化,在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的基礎(chǔ)上,心肌暫時(shí)性缺血會(huì)引起血管發(fā)生痙攣[7],心肌缺氧使酸性代謝產(chǎn)物刺激感覺(jué)神經(jīng)末梢,誘發(fā)心絞痛,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病血管管徑狹窄達(dá)75%以上,則可發(fā)生心肌梗死[8]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素誘發(fā)心肌缺血,既可以觀察復(fù)方山楂煎劑對(duì)高脂飲食引起冠狀動(dòng)脈損傷的影響,又可以觀察復(fù)方山楂煎劑對(duì)心肌損傷模型的影響。缺氧導(dǎo)致心肌產(chǎn)生大量氧自由基,氧自由基作用于細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,使膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管損傷,形成脂質(zhì)過(guò)氧化物,MDA是體內(nèi)重要的氧自由基的代謝產(chǎn)物,能較好地反映組織過(guò)氧化程度[9]。MDA是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一,使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷,改變膜的通透性,從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行[10]。氧自由基不但可以通過(guò)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷,還可以通過(guò)脂氫過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷[11]。脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA在體外影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性,它的產(chǎn)生可以加劇膜的損傷,因而MDA的含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度[12]。GSH-Px是體內(nèi)一種重要的過(guò)氧化物分解酶,GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,它可以使有毒的過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的羥基化合物,從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受損害。CK也稱為肌酸磷酸激酶,以心肌、平滑肌含量為多,CK主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中,與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、ATP再生、肌肉收縮有直接關(guān)系。CK活性測(cè)定可以用于心肌疾病的診斷,心肌梗死可引起CK水平病理性升高[13]。本研究通過(guò)喂飼高脂飼料10周造模,并給予相應(yīng)藥物治療,結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組比較,復(fù)方山楂煎劑組大鼠血清中MDA含量顯著降低,GSH-Px活性顯著提高,CK含量降低。表明復(fù)方山楂煎劑具有抗氧化作用,通過(guò)抗氧化減輕氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,進(jìn)而降低損傷的心肌細(xì)胞向血液中釋放CK。

動(dòng)脈粥樣硬化是指動(dòng)脈內(nèi)膜有脂質(zhì)沉積,平滑肌細(xì)胞增生,膠原纖維增多,形成粥糜樣壞死病灶,其病理改變是在動(dòng)脈內(nèi)膜面形成斑塊,有脂質(zhì)條紋、血栓形成和斑塊內(nèi)出血等繼發(fā)病變。油紅O脂肪染色法能顯示組織內(nèi)的脂肪,油紅O為脂溶性染料,在脂肪內(nèi)能高度溶解,可使組織內(nèi)三酰甘油等中性脂肪著色。本研究結(jié)果顯示,模型對(duì)照組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化積分顯著升高,動(dòng)脈內(nèi)膜有明顯的脂質(zhì)沉積;與模型對(duì)照組比較,復(fù)方山楂煎劑組動(dòng)脈粥樣硬化積分有所降低。

心肌梗死是由于心肌持久缺血、缺氧所引起的心肌壞死。心肌梗死組織鏡下觀察可見(jiàn)心肌纖維呈凝固性壞死,根據(jù)梗死時(shí)間不同,可有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽組織生長(zhǎng),大約5周后形成瘢痕組織。Caspases能調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程,Caspase-3、9、10具有促凋亡作用,以級(jí)聯(lián)的方式切割胞內(nèi)蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;Caspase-1、5、11具有促炎作用,可以介導(dǎo)特異性細(xì)胞因子的成熟,還參與細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡為細(xì)胞炎性壞死,其表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂,引起細(xì)胞內(nèi)容物釋放,激活強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的程序性死亡。與細(xì)胞凋亡相比,細(xì)胞焦亡發(fā)生較快,并伴隨大量促炎癥因子的釋放[14]。Caspase-1與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生關(guān)系密切,炎性細(xì)胞在體內(nèi)高度表達(dá)可引起心力衰竭,過(guò)度表達(dá)還可加重心力衰竭。本研究結(jié)果表明,復(fù)方山楂煎劑可降低Caspase-1在心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá),減少炎性因子釋放,最終減輕因心肌缺血導(dǎo)致的心肌損害。表明復(fù)方山楂煎劑可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、抗細(xì)胞焦亡等作用產(chǎn)生對(duì)心肌的保護(hù)作用。