基因Ⅰ型乙型腦炎病毒亞單位疫苗候選抗原的免疫原性比較

于瑞明，田占成，高閃電，獨(dú)軍政，劉光遠(yuǎn)，羅建勛，殷宏,2

·動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)·

基因Ⅰ型乙型腦炎病毒亞單位疫苗候選抗原的免疫原性比較

于瑞明1，田占成1，高閃電1，獨(dú)軍政1，劉光遠(yuǎn)1，羅建勛1，殷宏1,2

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046 2 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

為了篩選出免疫原性最佳的基因Ⅰ型乙型腦炎病毒亞單位疫苗候選抗原，將基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合基因、polytope復(fù)合表位基因和prMEIII-polytope融合基因分別克隆構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30a上，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得重組蛋白。將制備的重組蛋白免疫小鼠，通過ELISA監(jiān)測(cè)體液免疫反應(yīng)、通過噬斑減少中和試驗(yàn)滴定中和抗體滴度、通過細(xì)胞因子表達(dá)豐度和淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，比較分析制備的乙型腦炎病毒亞單位疫苗候選抗原的免疫原性。結(jié)果表明：獲得的分子量分別為35 kDa (prMEIII)、28 kDa (polytope復(fù)合表位抗原) 和57 kDa (prMEIII-polytope) 的重組蛋白均能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。與prMEIII-polytope和polytope重組蛋白免疫組相比，prMEIII蛋白可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生更高的IL-2和IFN- γ表達(dá)豐度和淋巴細(xì)胞增殖水平 (<0.05)。prMEIII蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度接近于商品化乙腦減毒疫苗SA14-14-2 (>0.05)。上述研究結(jié)果表明，prMEIII重組蛋白可以作為乙型腦炎病毒亞單位疫苗的備選蛋白。

流行性乙型腦炎，復(fù)合表位，亞單位疫苗，免疫原性

豬流行性乙型腦炎 (Japanese encephalitis，JE)是豬感染乙型腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 引起的一種自然疫源性疾病，許多動(dòng)物感染后都可成為本病的傳染源[1]。三帶喙庫蚊是該病毒的主要傳播媒介，叮咬豬后可傳染給豬，病毒在豬體內(nèi)可大量繁殖。因此，豬是該病毒的主要擴(kuò)增宿主[2]。豬感染JEV后，主要患生殖系統(tǒng)疾病，可造成懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬睪丸炎，使公豬的精子數(shù)量減少、活力降低。幸存的仔豬常出現(xiàn)震顫、驚厥等神經(jīng)癥狀。成年豬感染JEV后死亡率接近于零，但仔豬感染JEV后，死亡率可達(dá)100%[3]。據(jù)報(bào)道，隨著近年來JEV新基因型的出現(xiàn)[4]，基因Ⅰ型JEV毒株有替代基因Ⅲ型JEV毒株成為主要流行毒株的趨勢(shì)，且現(xiàn)有的基因Ⅲ型JEV減毒疫苗SA-14-14-2對(duì)部分基因Ⅰ型JEV流行毒株的保護(hù)力較差[5-9]。因此，基因Ⅰ型JEV疫苗研制的問題迫在眉睫。

JEV是單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球形，有囊膜[10]。prM/M和E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，E蛋白是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要免疫抗原[11]。prM蛋白是M蛋白的前體蛋白，以分子伴侶的形式輔助E蛋白正確折疊、組裝和運(yùn)輸，是E蛋白誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分[12]。JEV NS1蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體具有補(bǔ)體結(jié)合活性，通過介導(dǎo)細(xì)胞融合而獲得中和病毒的能力，從而抵抗JEV的感染和入侵[13]。此外，Kumar等用原核表達(dá)的NS3蛋白免疫小鼠，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)[14]。

盡管現(xiàn)有JEV減毒疫苗可用于豬場(chǎng)JE的防治，但安全性問題仍不可忽視[15]?；蚬こ虂唵挝灰呙缫蚱渲缓胁≡w抗原，不含核酸，具有安全性好、產(chǎn)量和純度高及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，盡管存在后續(xù)工藝優(yōu)化等諸多問題，但依然成為研制新型JEV疫苗的熱點(diǎn)之一[16]。本研究選取基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合蛋白，以及結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及軟件預(yù)測(cè)篩選的E蛋白 (EIII結(jié)構(gòu)域除外)、NS1和NS3蛋白抗原表位組成的polytope (復(fù)合表位)抗原和prMEIII-polytope融合蛋白免疫小鼠，比較這些JEV亞單位疫苗候選抗原的免疫原性，分析復(fù)合表位抗原polytope免疫原性的同時(shí)，觀察復(fù)合表位抗原polytope與prMEIII重組蛋白融合表達(dá)之后能否促進(jìn)prMEIII重組蛋白的免疫原性，以期篩選出基因Ⅰ型JEV亞單位疫苗的最佳候選抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

甘肅省平?jīng)鍪兄苓叺貐^(qū)收集的蚊蟲媒介分離的基因Ⅰ型JEV GS株[17]；幼年倉鼠腎 (Baby harmster kidney，BHK) 細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-30a均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Rosetta (DE3) 菌株購于天根生化科技(北京) 有限公司；豬乙型腦炎病毒減毒活疫苗(SA14-14-2) 購于中牧實(shí)業(yè)股份有限公司。雌性BALB/C小鼠 (4–6周齡) 由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自美國Sigma公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購于深圳達(dá)科為生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中JEV DH10M978 參考序列 (KT229573)，利用Primer Premier 5.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)克隆、表達(dá)和重疊延伸PCR所需引物 (表1)，委托生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.2.2 復(fù)合多表位基因的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[14,18]報(bào)道及網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器CTL Pred、Bce Pred和表位預(yù)測(cè)軟件Epitopia、Ellipro對(duì)基因Ⅰ型JEV GS株的E、NS1及NS3蛋白表位進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，綜合評(píng)價(jià)各分析軟件獲得的結(jié)果和文獻(xiàn)中所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選定13個(gè)表位氨基酸序列作為復(fù)合表位。為保證各表位之間功能的獨(dú)立性，T細(xì)胞表位之間用AAA作為L(zhǎng)inker，B細(xì)胞表位之間采用GPGPG作為L(zhǎng)inker，將各個(gè)表位串聯(lián)起來，合成得到polytope基因，序列如下所示：

表1 克隆、表達(dá)和融合PCR所需引物

Underline displayed restriction site.

1.2.3 基因的擴(kuò)增

TRIzol法從JEV感染的BHK21細(xì)胞中提取RNA，經(jīng)PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA模板，擴(kuò)增獲得prM、EIII基因，通過重疊 PCR方法獲得prMEIII融合基因，進(jìn)一步用表1中的引物與合成的polytope基因采用重疊延伸PCR的方法獲得prMEIII-polytope融合基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，膠回收目的片段。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化

將獲得的目的基因片段prMEIII、polytope、prMEIII-polytope及pET-30a載體分別進(jìn)行雙酶切處理，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化后，用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化.JM109感受態(tài)細(xì)胞，將PCR鑒定為陽性的菌液委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a-prMEIII、pET-30a-polytope和pET-30a-prMEIII-polytope。將陽性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化.Rosetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在0 h和6 h取樣用于SDS-PAGE檢測(cè)。誘導(dǎo)后的菌體沉淀經(jīng)超聲后4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清和沉淀用于SDS-PAGE檢測(cè)。按照Ni-NTA Superflow Cartridge手冊(cè)進(jìn)行鎳柱親和層析純化重組蛋白，用Solarbio公司的Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化的重組蛋白濃度。純化后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 免疫印跡分析

為了檢測(cè)prMEIII融合蛋白鼠源多克隆抗體與JEV天然蛋白的反應(yīng)原性，收集基因Ⅰ型JEV GS株感染BHK21細(xì)胞48 h后的細(xì)胞樣品，SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印PVDF膜進(jìn)行免疫印跡分析，以prMEIII融合蛋白免疫小鼠制備的血清為一抗(1∶500稀釋)，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗 (1∶6 000稀釋)，用NBT/BCIP顯色，PBS免疫小鼠的血清作為陰性對(duì)照。同時(shí)將純化的重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，用Trans-Blot?Turbo?轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印PVDF膜進(jìn)行免疫印跡分析，以小鼠抗多聚組氨酸單克隆抗體為一抗 (1∶1 000稀釋)，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗 (1∶6 000稀釋)，用NBT/BCIP顯色。

1.2.6 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)方案

將40只4–6周齡雌性BALB/C小鼠按照8只/組，分為5組，開展動(dòng)物免疫試驗(yàn)。各組小鼠在第0、14和28天分別免疫一次，蛋白免疫組 (prMEIII、polytope和prMEIII-polytope) 一免和二免采用背部皮下多點(diǎn)注射含有免疫佐劑的50 μg抗原進(jìn)行免疫。一免用弗氏完全佐劑，二免用弗氏不完全佐劑，三免采用腹腔注射100 μg不含佐劑的抗原加強(qiáng)免疫。SA14-14-2弱毒疫苗免疫組和PBS免疫組免疫劑量為200 μL。第0、7、14、21、28、35、42天，通過小鼠尾尖采血制備血清，?20 ℃凍存?zhèn)溆?，?2天各免疫組隨機(jī)取3只小鼠眼球采血制備血清用于細(xì)胞因子表達(dá)豐度和中和抗體滴度滴定，斷頸處死后，采集脾臟制備淋巴細(xì)胞用于淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 特異性抗體水平監(jiān)測(cè)

應(yīng)用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清中特異性抗體水平，將鎳柱親和層析純化的EIII蛋白[17]0.5 μg/孔包被板子，5%脫脂奶粉封閉，每孔加入從1︰100開始2倍倍比稀釋的免疫小鼠血清作為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (1∶2 500) 作為二抗，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光光度值，以P/N>2.1的血清最大稀釋倍數(shù)為被檢血清特異性抗體效價(jià)。

1.2.8 中和抗體滴度測(cè)定

噬斑減少中和試驗(yàn)測(cè)定初免后第42 天采集的各免疫組小鼠血清中和抗體滴度，將各免疫組小鼠血清56 ℃滅活30 min，從1∶10開始進(jìn)行 2倍倍比稀釋，將稀釋的血清與含有100 PFU的病毒液等體積混合，設(shè)PBS免疫小鼠血清處理病毒組作為對(duì)照組，以能減少對(duì)照組50%空斑數(shù)的血清最高稀釋度為該血清的中和抗體效價(jià)。

1.2.9 細(xì)胞因子表達(dá)豐度檢測(cè)

應(yīng)用達(dá)優(yōu)?小鼠細(xì)胞因子ELISA試劑盒檢測(cè)初免后第42 天采集的各免疫組小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的表達(dá)水平。

1.2.10 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將制備的2×106/mL的淋巴細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，加入終濃度為 5 μg/mL的免疫抗原刺激淋巴細(xì)胞，每個(gè)樣品重復(fù)3孔，并設(shè)ConA (終濃度為5 μg/mL) 刺激細(xì)胞陽性對(duì)照和空白細(xì)胞陰性對(duì)照，將96孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入10 μL WST-1溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3–4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450值，計(jì)算刺激指數(shù) (SI)=450，試驗(yàn)–450，對(duì)照/450，對(duì)照–450，空白。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism Version 5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用單因素方差分析或檢驗(yàn)分析各免疫組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異 (<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的擴(kuò)增

以JEV cDNA和pUC57-polytope為模板，擴(kuò)增得到基因prM (501 bp)、EIII (282 bp)和polytope (627 bp)基因，通過重疊延伸PCR的方法獲得prMEIII融合基因(786 bp)和prMEIII-polytope融合基因 (1 416 bp) (圖1)，獲得的目的片段與預(yù)期大小一致。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組prMEIII和prMEIII-polytope蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，分子量大小分別約為35 kDa和57 kDa，重組polytope蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，分子量大小約為28 kDa，進(jìn)一步經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得了純度較高的重組蛋白 (圖2)。純化的prMEIII、polytope和prMEIII-polytope重組蛋白的濃度分別是600 μg/mL、800 μg/mL和530 μg/mL。

圖1 PCR擴(kuò)增靶基因

圖2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

2.3 prMEIII融合蛋白鼠源多克隆抗體與JEV天然抗原的特異性反應(yīng)

免疫印跡分析結(jié)果表明，prMEIII蛋白免疫小鼠制備的血清能夠特異性識(shí)別JEV的53 kDa的E蛋白和19 kDa的prM蛋白 (圖3A)?？菇M氨酸蛋白抗體特異性識(shí)別了純化的重組蛋白，分子量大小分別為35 kDa (prMEIII)、28 kDa (polytope) 和57 kDa (prMEIII-polytope)，與預(yù)期重組蛋白分子量大小一致 (圖3B)。

2.4 特異性抗體水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

通過間接ELISA測(cè)定第0、7、14、21、28、35、42天收集的免疫小鼠血清中的特異性抗體。結(jié)果顯示，3種基因重組表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫組和減毒疫苗免疫組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體, 但減毒疫苗SA-14-14-2免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平顯著低于本研究所重組表達(dá)的蛋白免疫組 (圖4)。

圖3 重組蛋白及prMEIII重組蛋白制備抗體的特異性免疫反應(yīng)性分析

圖4 特異ELISA抗體滴度動(dòng)態(tài)曲線

2.5 中和抗體滴度的測(cè)定

噬斑減少中和試驗(yàn)測(cè)定免疫小鼠血清的中和抗體滴度，結(jié)果顯示，prMEIII蛋白免疫組平均中和抗體滴度為1∶200，polytope蛋白免疫組平均中和抗體滴度為1∶50，prMEIII-polytope蛋白免疫組平均中和抗體滴度為1∶80，SA14-14-2減毒疫苗組平均中和抗體滴度為1∶240。prMEIII蛋白免疫組平均中和抗體滴度顯著高于其他蛋白免疫組 (polytope和prMEIII-polytope) (<0.05)，接近于SA14-14-2減毒疫苗免疫組 (>0.05) (圖5)。

圖5 中和抗體滴度檢測(cè)

2.6 細(xì)胞因子表達(dá)豐度檢測(cè)

利用細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)首免后第42 天小鼠血清中的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，prMEIII蛋白免疫組的細(xì)胞因子 (IL-2、IFN-γ和IL-4) 表達(dá)水平顯著高于其他蛋白免疫組 (<0.05)，其中IL-4的表達(dá)水平最高，與其他蛋白免疫組和商品化減毒疫苗SA14-14-2免疫組相比差異極顯著 (<0.01)，而prMEIII蛋白免疫組的IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平與商品化減毒疫苗SA14-14-2免疫組相比差異不顯著 (>0.05) (圖6)。

圖6 免疫小鼠血清中的細(xì)胞因子表達(dá)豐度

2.7 淋巴細(xì)胞增殖水平檢測(cè)

利用WST法測(cè)定免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力，以評(píng)價(jià)重組蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示，prMEIII-polytope蛋白免疫組的SI值為1.75±0.95，prMEIII 蛋白免疫組SI值為2.465±0.065，polytope免疫組SI值為1.68±0.06，SA14-14-2減毒疫苗組用prMEIII融合蛋白刺激的SI值為1.76±0.085，而用ConA刺激的SI值為2.365±0.075。prMEIII蛋白免疫組的刺激指數(shù)顯著高于其他免疫組 (<0.05)，但與ConA刺激的SA14-14-2減毒疫苗組SI值接近(圖7)。

3 討論

疫苗接種是預(yù)防人類和豬流行性乙型腦炎的最有效方法，減毒或嵌合減毒JEV活疫苗對(duì)于懷孕母豬的安全性存在爭(zhēng)議[15]，福爾馬林滅活改變了E蛋白的抗原結(jié)構(gòu)，影響了滅活JEV疫苗的免疫效力[19]。盡管現(xiàn)有疫苗存在一定問題，但目前仍是預(yù)防JEV感染的首選[20]。因此，研制安全高效且成本低廉的新型JEV疫苗勢(shì)在必行。病毒樣顆粒因其空間結(jié)構(gòu)類似于天然病毒粒子，其免疫保護(hù)效果接近于減毒疫苗，但由于生產(chǎn)成本的問題和達(dá)不到規(guī)?；a(chǎn)的要求，病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)任重而道遠(yuǎn)。因此，其他類型蛋白亞單位疫苗成為研發(fā)新型JEV疫苗的熱點(diǎn)之一[16]。疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)與所選擇的抗原密切相關(guān)，因此，篩選出最有效的疫苗候選抗原對(duì)于疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)至關(guān)重要[21-23]。為了篩選出免疫效應(yīng)能接近JEV減毒疫苗的最佳抗原單位，本研究選取基因Ⅰ型JEV GS株的prMEIII融合蛋白、E蛋白 (除EIII結(jié)構(gòu)域) 、NS1和NS3蛋白的抗原表位串聯(lián)形成的復(fù)合表位polytope抗原和prMEIII-polytope融合蛋白，通過免疫小鼠比較這些候選抗原的免疫原性。本研究獲得了3個(gè)與預(yù)期分子量大小一致的純度較高的融合蛋白 (prMEIII、polytope和prMEIII-polytope)，prMEIII融合蛋白免疫小鼠制備的血清可特異性識(shí)別JEV的天然E蛋白和prM蛋白，動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，prMEIII融合蛋白的免疫原性顯著優(yōu)于其他候選抗原，可為JEV亞單位疫苗和診斷試劑的研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)抗原。

圖7 免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

通過ELISA方法評(píng)估免疫小鼠誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)水平，重組蛋白免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的平均特異性抗體水平顯著高于商品化減毒疫苗SA14-14-2免疫組，這可能是由于ELISA包被抗原采用的是基因Ⅰ型JEV來源的EIII蛋白，而SA14-14-2減毒疫苗屬于基因Ⅲ型JEV，JEV不同基因型之間E蛋白抗原性的差異導(dǎo)致測(cè)得的SA14-14-2減毒疫苗免疫組的平均抗體效價(jià)很低[24]。盡管這樣，SA14-14-2減毒疫苗免疫組的細(xì)胞因子IL-4、IL-2和IFN-γ的表達(dá)水平接近于prMEIII蛋白免疫組，顯著高于polytope和prMEIII- polytope蛋白免疫組。SA14-14-2減毒疫苗免疫小鼠可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，該細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對(duì)于抵抗乙型腦炎病毒的感染和入侵至關(guān)重要，特別是Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)[25]。prMEIII蛋白免疫組的細(xì)胞因子 (IFN-γ、IL-2和IL-4) 表達(dá)水平均顯著高于polytope和prMEIII-polytope蛋白免疫組，說明prMEIII蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，這同淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，prMEIII蛋白免疫組的淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于polytope和prMEIII-polytope蛋白免疫組。此外，prMEIII蛋白免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的平均中和抗體水平接近于SA14-14-2減毒疫苗免疫組。據(jù)此推斷，SA14-14-2減毒疫苗與本研究中的基因Ⅰ型JEV GS株可能具有較好的交叉免疫保護(hù)性。此外，復(fù)合表位抗原polytope集合了JEV E、NS1和NS3多個(gè)基因的主要抗原表位，但在本研究中所表現(xiàn)的免疫效力指標(biāo)并不理想，盡管在polytope中存在NS1的多個(gè)抗原表位，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能否具有抵抗JEV的感染和入侵的補(bǔ)體結(jié)合活性[26]還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)將polytope和prMEIII蛋白融合表達(dá)之后，反而降低了prMEIII重組蛋白的免疫效力。推斷其可能是polytope與prMEIII蛋白融合表達(dá)后，影響了prMEIII蛋白有效表位的空間構(gòu)象展示。因此，prMEIII蛋白被認(rèn)為是本研究中研制新型JEV疫苗的最佳疫苗候選抗原。

綜上所述，本研究制備的JEV亞單位疫苗候選抗原免疫小鼠均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中prMEIII融合蛋白免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平接近于商品化減毒疫苗SA14-14-2，該研究為今后JEV亞單位疫苗的研制提供了新的思路。

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Comparson of the immunogenicity of genotypeⅠJapanese encephalitis virus subunit vaccine candidate antigens

Ruiming Yu1, Zhancheng Tian1, Shandian Gao1, Junzheng Du1, Guangyuan Liu1, Jianxun Luo1, and Hong Yin1,2

1 State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China 2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

To screen the best genotypeⅠJapanese encephalitis virus subunit vaccine candidate antigens, the prMEIII gene, the polytope gene and the prMEIII-polytope fusion gene of the GenotypeⅠJapanese encephalitis virus GS strain were cloned into prokaryotic expression vector pET-30a. The recombinant proteins were obtained after the induction and purification. The prepared recombinant proteins were immunized to mice, and the immunogenicity of the subunit vaccine candidate antigens was evaluated through monitoring the humoral immune response by ELISA, detecting the neutralizing antibody titer by plaque reduction neutralization test, and testing the cell-mediated immune response by lymphocyte proliferation assay and cytokine profiling. The recombinant proteins with the molecular weights of 35 (prMEIII), 28 (polytope antigen) and 57 kDa (prMEIII-polytope) induced strong humoral and cellular immune responses in mice. Compared with prMEIII-polytope and polytope proteins, the prMEIII protein induced a significant expression of IL-2 and IFN-γ (<0.05) and the significant lymphoproliferation of splenocytes (<0.05). The neutralizing antibody titer induced by the prMEIII protein was close to that induced by the commercial attenuated vaccine SA14-14-2 (>0.05). The study suggests that the prMEIII protein can be used for the development of the Japanese encephalitis virus subunit vaccine.

Japanese encephalitis, polytope, subunit vaccine, immunogenicity

10.13345/j.cjb.190522

November 22, 2019;

March 23, 2020

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31201899), Agricultural Science and Technology Innovation Engineering Project (No. CAAS-ASTIP-2016-LVRI).

Zhancheng Tian. Tel: +86+931-8342681; E-mail: tianzhancheng@caas.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31201899)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(No. CAAS-ASTIP-2016-LVRI) 資助。

2020-05-06

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20200430.1642.001.html

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(本文責(zé)編 郝麗芳)