張 芳 ,任 毅，嚴(yán)勇亮，付婧璇，耿洪偉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)作物品種資源研究所，新疆烏魯木齊 830091)

千粒重是小麥產(chǎn)量構(gòu)成三要素之一，提高千粒重是小麥增產(chǎn)的有效途徑和重要育種目標(biāo)[1]。小麥千粒重是受微效多基因控制的數(shù)量性狀，利用可靠的分子標(biāo)記可提高對(duì)小麥粒重選擇的準(zhǔn)確性和有效性，有利于對(duì)高千粒重優(yōu)異基因型在小麥育種中的充分應(yīng)用[2]。產(chǎn)量三要素中千粒重是最穩(wěn)定，具有59%～80%的廣義遺傳率[3]。胡延吉等[4]認(rèn)為，粒重的增加是提高小麥產(chǎn)量的主導(dǎo)因素。馮素偉等[5]發(fā)現(xiàn)，在穗粒數(shù)的貢獻(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定時(shí)，提高千粒重則成為小麥增產(chǎn)的關(guān)鍵因素。由此可見(jiàn)，粒重的遺傳改良是對(duì)小麥高產(chǎn)非常重要[6]。國(guó)內(nèi)外的研究表明，過(guò)去的幾十年中，小麥穗數(shù)和穗粒數(shù)的改良相對(duì)緩慢，且對(duì)產(chǎn)量提升貢獻(xiàn)較小，而千粒重的提高對(duì)小麥產(chǎn)量的提升貢獻(xiàn)較大[7-11]。因此，在小麥品種選育過(guò)程中，注重千粒重的選擇是提高小麥產(chǎn)量的重要途徑，也成為小麥分子標(biāo)記輔助育種的一個(gè)重要內(nèi)容[12]。

近年來(lái)，小麥粒重相關(guān)基因定位取得了很大進(jìn)展[13-14]。Cui等[15]在5B、6A和7B染色體上發(fā)現(xiàn)3個(gè)與粒重相關(guān)的主效QTL，分別解釋表型變異的11.28%～16.06%、5.64%～18.69%和 6.76%～21.16%。Jia等[16]利用來(lái)自RIL群體南大2419/望水白的230個(gè)家系，將粒重主效QTL定位于3A、4B、4D和5A染色體上。Huang等[17]在2D、4B和5A染色體上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)粒重主效QTL。與此同時(shí)，作為育種應(yīng)用的理想標(biāo)記，功能標(biāo)記被用于小麥粒重基因鑒定和克隆[18-19]。Zhang等[20]克隆了普通小麥7DS染色體上的籽粒大小基因TaGS-D1的全長(zhǎng)編碼序列，并基于40 bp 的插入/缺失(Indel)，開(kāi)發(fā)了與千粒重顯著相關(guān)(P<0.01)的共顯性功能標(biāo)記GS7D。該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因TaGS-D1a和TaGS-D1b分別與高千粒重和低千粒重相關(guān)，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為562和522 bp。利用GS7D標(biāo)記對(duì)51份新疆冬小麥進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記能較好地區(qū)分TaGS-D1a和TaGS-D1b等位基因[21]。Flo2是廣泛存在植物中的基因家族，小麥TaFlo2基因與粒重緊密相關(guān)，其表達(dá)量對(duì)小麥籽粒的淀粉含量和蛋白質(zhì)合成有影響，從而影響小麥的粒重。Sajjad等[22]克隆了普通小麥2A染色體上的粒重基因TaFlo2-A1的全長(zhǎng)編碼序列，并根據(jù)其等位基因TaFlo2-A1a和TaFlo2-A1b在啟動(dòng)子區(qū)存在8 bp的插入/缺失(Indel)，開(kāi)發(fā)了一對(duì)共顯性功能標(biāo)記TaFlo2-Indel8。TaFlo2-Indel8標(biāo)記可在具有等位基因TaFlo2-A1a(與低千粒重相關(guān))和TaFlo2-A1b(與高千粒重相關(guān))的材料中分別擴(kuò)增出153和 145 bp的片段。雖然目前有許多小麥粒重相關(guān)基因的分子標(biāo)記被開(kāi)發(fā)和利用[23-26]，但TaGS-D1和TaFlo2-A1為粒重基因研究的主要對(duì)象。這些研究多是對(duì)單個(gè)基因效應(yīng)進(jìn)行分析，而對(duì)不同粒重基因組合對(duì)千粒重影響尚不清楚。基于此，本研究利用粒重功能標(biāo)記GS7D和TaFlo2-Indel8對(duì)298份國(guó)內(nèi)外冬小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各等位基因、基因組合與千粒重的相關(guān)性及其在不同小麥類(lèi)型中分布規(guī)律進(jìn)行分析，以期探究不同粒重基因型對(duì)千粒重的作用，為小麥粒重分子聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的298份冬小麥品種(系)來(lái)自12個(gè)國(guó)家，包括65份國(guó)外品種(系)及233份國(guó)內(nèi)四個(gè)主要冬麥區(qū)的歷史品種(系)和當(dāng)前主栽品種(表2)。其中，國(guó)外冬小麥品種(系)分別來(lái)自法國(guó)(21份)、意大利(9份)、美國(guó)(7份)、阿根廷(7份)、羅馬尼亞(6份)、俄羅斯(5份)、日本(4份)、匈牙利(2份)、澳大利亞(1份)、德國(guó)(1份)、英國(guó)(1份)、土耳其(1份)；國(guó)內(nèi)冬小麥品種(系)分別來(lái)自黃淮冬麥區(qū)(145份)、北部冬麥區(qū)(55份)、西南冬麥區(qū)(22份)和長(zhǎng)江中下游區(qū)冬麥區(qū)(11份)。所有小麥品種(系)均于2016-2017年和2017-2018年度在新疆農(nóng)科院瑪納斯試驗(yàn)站種植。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2個(gè)重復(fù)，行長(zhǎng)2 m，行距25 cm，3行區(qū)，每行播量為100粒，田間管理同大田生產(chǎn)，正常成熟后及時(shí)收獲，人工脫粒。

1.2 千粒重測(cè)定

采用杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司生產(chǎn)的SC-G型千粒重儀測(cè)定小麥千粒重，3次重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA提取

為避免單粒種子偶然性錯(cuò)誤，每個(gè)品種(系)選取3 粒粒型均勻的種子，粉碎后放入2.0 mL離心管中，參照Lagudah等[27]方法提取基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

利用Zhang等[20]開(kāi)發(fā)的共顯性標(biāo)記GS7D檢測(cè)小麥7DS染色體上粒重基因TaGS-D1等位基因；利用Sajjad等[22]開(kāi)發(fā)的共顯性標(biāo)記TaFlo2-Indel8檢測(cè)小麥2AL染色體上粒重基因TaFlo2-A1等位基因。引物(表1)均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 目標(biāo)基因分子標(biāo)記信息

PCR體系15 μL，含1 μL的DNA為模板，2×Es Taq MasterMix(Dye)7.5 μL(康為世紀(jì))，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)充至15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55～59 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。其中，標(biāo)記GS7D的PCR產(chǎn)物在4.0%瓊脂糖凝膠(加入核酸染料)上進(jìn)行電泳分離，在VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)紫外燈掃描成像并保存到計(jì)算機(jī)；標(biāo)記TaFlo2-Indel8的擴(kuò)增產(chǎn)物用6.0%的變形聚丙酰胺凝膠電泳分離，銀染后記錄結(jié)果。

表2 中國(guó)和國(guó)外小麥品種(系)的千粒重及基因型

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010對(duì)測(cè)定的千粒重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，并利用 SPSS 21軟件對(duì)同一基因不同等位基因品種的千粒重進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)和不同基因型品種的千粒重間進(jìn)行鄧肯法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥千粒重的表型變異

298份小麥品種(系)的兩年千粒重平均值為37.65 g，變化范圍為24.72～46.82 g，變異系數(shù)為12.31%；國(guó)外材料的平均千粒重低于國(guó)內(nèi)各冬麥區(qū)的材料(表3)。

2.2 TaGS-D1和 TaFlo2-A1位點(diǎn)不同等位基因及其組合頻率分布

在298份冬小麥品種(系)中，利用GS7D標(biāo)記檢測(cè)出TaGS-D1a和TaGS-D1b2種等位基因，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別是562和522 bp(圖1)，其中具有高千粒重TaGS-D1a等位基因的材料有236份(占79.2%)，具有低千粒重TaGS-D1b等位基因的材料有62份(占20.8%)。TaGS-D1a和TaGS-D1b在國(guó)外及國(guó)內(nèi)各冬麥區(qū)中分布不同(表4)。在所有材料中，整體上TaGS-D1a的分布頻率大于TaGS-D1b。從材料來(lái)源看，TaGS-D1a的分布頻率表現(xiàn)為西南冬麥區(qū)(95.5%)>長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(90.9%)>北部冬麥區(qū)(85.5%)>黃淮冬麥區(qū)(78.6%)>國(guó)外(55.4%)。

M:DL2000；1:小偃6號(hào)；2:豫麥47；3:周麥25；4:魯麥7號(hào)；5:濟(jì)麥21；6:阿夫；7:碧螞1號(hào)；8:百農(nóng)3217;9:魯麥9號(hào);10:周麥31；11:泰農(nóng)731；12:豫麥21.

在供試材料中，利用TaFlo2-Indel8標(biāo)記共擴(kuò)增出145和153 bp兩種片段類(lèi)型(圖2)，說(shuō)明存在TaFlo2-A1b和TaFlo2-A1a2種等位基因。在298份冬小麥品種(系)中，56份具有高千粒重TaFlo2-A1b等位基因，242份具有低千粒重TaFlo2-A1a等位基因，說(shuō)明具有高千粒重TaFlo2-A1b等位基因的材料分布頻率(18.8%)低于具有低千粒重TaFlo2-A1a等位基因的材料(81.2%)。從材料來(lái)源看，在參試材料中TaFlo2-A1b的分布頻率表現(xiàn)為長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(36.4%)>北部冬麥區(qū)(27.3%)>黃淮冬麥區(qū)(18.6%)>西南冬麥區(qū)(13.6%)>國(guó)外(10.8%)(表4)。

表4 不同類(lèi)型冬小麥品種(系)等位變異的分布頻率

M:DL2000；1:淮麥18；2:淮麥20；3:淮麥21；4:皖麥29；5:皖麥33；6:皖麥38；7:矮抗58；8:武農(nóng) 148；9:新麥19；10:新麥9號(hào)；11:豫麥13；12:豫麥18；13:豫麥34；14:豫麥35;15:豫麥57;16:蘭考906；17:豫麥47；18:豫麥49；19:鄭9023；20:中麥892；21:中麥871；22:周麥12；23:周麥16；24:周麥18；25:周麥19；26:周麥23；27:周麥30；28:揚(yáng)麥15；29:魯麥23；30:煙農(nóng)18.

在298份參試材料中共檢測(cè)出4種基因組合(基因型)，分別為T(mén)aGS-D1a/TaFlo2-A1b、TaGS-D1a/TaFlo2-A1a、TaGS-D1b/TaFlo2-A1b和TaGS-D1b/TaFlo2-A1a，其分布頻率分別為15.4%、63.4%、3.0%和18.1%(表5)。在國(guó)內(nèi)各冬麥區(qū)和國(guó)外品種(系)中，TaGS-D1a/TaFlo2-A1a基因型均占比最大，TaGS-D1b/TaFlo2-A1b基因型均占比最小或沒(méi)有。高千粒重基因型在不同小麥類(lèi)型中均占比較小，且國(guó)外品種(系)均低于國(guó)內(nèi)各冬麥區(qū)材料。不同來(lái)源小麥材料中4種基因型的分布頻率不同。其中，TaGS-D1a/TaFlo2-A1b基因型在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)分布頻率較高，達(dá)到36.4%；TaGS-D1a/TaFlo2-A1a基因型在西南冬麥區(qū)分布頻率較高，占比86.4%；TaGS-D1b/TaFlo2-A1b基因型在國(guó)外品種(系)中的分布頻率較高，為4.6%；TaGS-D1b/TaFlo2-A1a基因型在國(guó)外品種(系)中的分布頻率較高，達(dá)到36.9%。這說(shuō)明國(guó)內(nèi)小麥資源中高千粒重的TaGS-D1a/TaFlo2-A1b基因型豐富，尤其是在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)分布較多，而低千粒重的TaGS-D1b/TaFlo2-A1a基因型在國(guó)外品種(系)中分布較多。

2.3 TaGS-D1和 TaFlo2-A1位點(diǎn)不同等位基因及其組合千粒重比較

對(duì)TaGS-D1和TaFlo2-A1等位基因及其組合的平均千粒重進(jìn)行分析(表5)表明，TaGS-D1a和TaFlo2-A1b等位基因的平均千粒重分別為38.18和39.12 g，均極顯著高于對(duì)應(yīng)的等位基因TaGS-D1b和TaFlo2-A1a，進(jìn)一步印證TaGS-D1a和TaFlo2-A1b等位基因與高千粒重相關(guān)，屬于優(yōu)異等位變異。在TaGS-D1和TaFlo2-A1位點(diǎn)形成的4種基因型中，TaGS-D1a/TaFlo2-A1b的平均千粒重為39.82 g，極顯著高于其他基因型；TaGS-D1b/TaFlo2-A1a的平均千粒重為35.59 g，低于其他3種基因型，說(shuō)明TaGS-D1a/TaFlo2-A1b與高千粒重相關(guān)且為最優(yōu)組合，對(duì)千粒重的增加具有較大作用，且高于單一高千粒重等位基因增效作用。

表5 不同基因間和不同基因型間千粒重分析

3 討 論

小麥粒重相關(guān)分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)小麥育種效率至關(guān)重要[28]。盡管粒重基因在品種間和環(huán)境間均存在顯著差異，但主要受遺傳控制，通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)，可有效提高小麥高產(chǎn)育種效率。利用TaGS-D1位點(diǎn)功能標(biāo)記GS7D和TaFlo2-A1位點(diǎn)功能標(biāo)記TaFlo2-InDel8可較好地區(qū)分出小麥千粒重的大小。Zhang等[20]利用TaGS-D1位點(diǎn)的顯性標(biāo)記GS7D檢測(cè) 175 份中國(guó)小麥材料，結(jié)果表明，TaGS-D1a等位基因分布頻率較高(80%)，TaGS-D1a等位基因是優(yōu)異及優(yōu)勢(shì)等位變異。簡(jiǎn)大為等也[21]印證了在51份新疆冬小麥資源中TaGS-D1a等位基因(70.6%)分布頻率明顯高于TaGS-D1b等位基因(29.4%)。Sajjad等[22]利用TaFlo2-A1位點(diǎn)的顯性標(biāo)記TaFlo2-InDel8檢測(cè)262份中國(guó)小麥微核心種質(zhì)，結(jié)果顯示TaFlo2-A1b占比僅為16.5%。本研究利用兩對(duì)功能標(biāo)記GS7D和TaFlo2-InDel8對(duì)298份冬小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與Zhang等[20]和Sajjad等[22]研究基本一致。其中高千粒重TaGS-D1a分布頻率較高，可能與育種家在品種選育過(guò)程中優(yōu)先選擇該等位變異有關(guān)。而高千粒重TaFlo2-A1b分布頻率較低，可能與千粒重受多基因控制有關(guān)，其效應(yīng)被其他粒重基因所掩蓋，僅在少數(shù)材料中體現(xiàn)出高千粒重TaFlo2-A1b等位基因。雖然TaFlo2-A1b等位基因分布頻率遠(yuǎn)低于TaFlo2-A1a等位基因，但TaFlo2-A1b等位基因材料較TaFlo2-A1a等位基因材料差異極顯著(P<0.01)。

不同來(lái)源小麥品種(系)中，具有高千粒重的TaGS-D1a和TaFlo2-A1b等位基因及其TaGS-D1a/TaFlo2-A1b基因型的分布頻率均存在較大差異(表4)，其中長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)高千粒重分布頻率較高，而國(guó)外品種(系)分布較低。究其原因一方面可能與多年粒重人工選擇有關(guān)。長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)以大穗大粒選擇為主，對(duì)粒重的重視程度和選擇力度較強(qiáng)，而國(guó)外品種產(chǎn)量的變化體現(xiàn)在穗粒數(shù)和穗數(shù)，千粒重變化不大，對(duì)高千粒重選擇較小，該等位基因未被廣泛選擇利用[29]。另一方面可能與育種需求及不同地理環(huán)境的生態(tài)條件有關(guān)。高千粒重小麥將更有利于我國(guó)小麥粒重遺傳改良及篩選高產(chǎn)品種。我國(guó)長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)氣候溫和，雨水充沛，但易發(fā)生病蟲(chóng)害，導(dǎo)致穗數(shù)不足，千粒重優(yōu)勢(shì)突出[30]，而國(guó)外人口密度基數(shù)較小，對(duì)于高千粒重選育需求相對(duì)較低，因此高千粒重TaGS-D1a和TaFlo2-A1b等位基因育種選擇利用將集中在個(gè)別少數(shù)國(guó)家中。此外，還可能在品種改良過(guò)程中，我們僅關(guān)注國(guó)外材料中的一些個(gè)別性，從而造成國(guó)外品種(系)中高千粒重TaGS-D1a和TaFlo2-A1b等位基因占比較少，同時(shí)反映出不同地域品種在遺傳組成上的明顯差異[31-33]。

從小麥主栽品種推廣應(yīng)用以及目前一些新品種的高產(chǎn)紀(jì)錄來(lái)看，高千粒重對(duì)我國(guó)小麥產(chǎn)量的提高至關(guān)重要[34,2]。高千粒重TaGS-D1a/TaFlo2-A1b基因型的千粒重顯著高于其他組合，且高于單基因高千粒重TaGS-D1a與TaFlo2-A1b等位基因，說(shuō)明高千粒重基因型將對(duì)小麥粒重遺傳改良具有較大的提升空間，同時(shí)可作為小麥粒重的輔助選擇的實(shí)用性標(biāo)記。時(shí)佳等[35]也證明了較單一高千粒重等位基因，多個(gè)基因型可獲得更高千粒重。品種審定中可利用高千粒重基因型將有效準(zhǔn)確地獲得高千粒重品種材料；育種家在高千粒重選育過(guò)程中也可以通過(guò)TaGS-D1a/TaFlo2-A1b基因型，對(duì)其選配親本提供研究基礎(chǔ)[36]，篩選出具有高產(chǎn)潛力的小麥種植資源，從而提升我國(guó)小麥千粒重。千粒重除受多基因控制外，還受籽粒大小、灌漿速率等因素影響。在今后的高千粒重小麥品種選育過(guò)程中，對(duì)基因型的累加聚合和多指標(biāo)綜合分析十分重要，將是一種高產(chǎn)育種的研究方向，可加速高產(chǎn)小麥育種步伐。