王廣交，辛嘉英，孫立瑞，崔添玉，許錫凱，張嘉玉

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

甲烷氧化菌是以甲烷為碳源,在液體無機鹽培養(yǎng)基中生長的一種革蘭氏陰性好氧菌。在細胞內(nèi)發(fā)生代謝反應(yīng)將甲烷轉(zhuǎn)換為一些重要的化工產(chǎn)品，近年來國內(nèi)外研究學者在研究創(chuàng)立的“甲烷生物精煉廠”，就是利用甲烷氧化菌將甲烷轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)生活所需的物質(zhì)如胞外多糖、單細胞蛋白、聚-3-羥基丁酸(PHB)、四氫嘧啶等[1]。其中四氫嘧啶的生物合成是目前學術(shù)領(lǐng)域研究的熱潮之一。

四氫嘧啶是氨基酸的衍生物，一種環(huán)狀亞氨基酸，由于其具有手性特征[2]，化學方法難以合成無毒的四氫嘧啶，故選擇生物合成的方法。其最初發(fā)現(xiàn)于一種光能自養(yǎng)型菌中，隨著研究范圍的擴大，在許多好氧嗜鹽和耐鹽的革蘭氏陽性細菌中也發(fā)現(xiàn)有不同含量四氫嘧啶的存在[3]。自1997年以來，一些甲烷氧化菌如嗜鹽甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z)，以及海洋甲基球菌屬(Methylobactermarinus)和酌鄄變形菌綱(Methylohalobiuscremeensis)等已被證明在高滲透條件下可以利用甲烷氧化菌生物轉(zhuǎn)化合成四氫嘧啶[4]以抵御高滲透壓環(huán)境，達到保護自身細胞的目的[5]。

甲烷氧化菌使用無機鹽培養(yǎng)，無毒條件下合成的四氫嘧啶，可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥化學、化妝品等領(lǐng)域。甲烷氧化菌合成四氫嘧啶的途徑是天冬氨酸家族氨基酸合成的一個分支，天冬氨酸首先被天冬氨酸激酶轉(zhuǎn)化為β-天冬氨酸磷酸,該酶是天冬氨酸家族氨基酸(蘇氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸)和四氫嘧啶生物合成的共同起點，通過“滲透性控制”改變天冬氨酸激酶活性使四氫嘧啶生物合成途徑獨立于通?？刂铺於彼峒易灏被岷铣赏緩降膹碗s控制機制，在高滲透壓刺激下應(yīng)激表現(xiàn)出高活性[6]。這條代謝途徑主要通過三種酶，二氨基丁酸(DABA)氨基轉(zhuǎn)移酶，DABA乙酰轉(zhuǎn)移酶和四氫嘧啶合成酶調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的發(fā)生最終合成四氫嘧啶[7-8]，具體代謝途徑如下：首先DABA氨基轉(zhuǎn)移酶(EctB)催化天冬氨酸β-半醛轉(zhuǎn)氨生成L-二氨基丁酸(L-DABA)、二氨基丁酸(DABA)和乙酰輔酶A發(fā)生乙?；磻?yīng)生成Nγ-乙酰-DABA，該步反應(yīng)在DABA乙酰轉(zhuǎn)移酶(EctA)催化下發(fā)生，在四氫嘧啶合成酶催化下Nγ-乙酰-DABA脫水環(huán)化，最終生成四氫嘧啶。合成路徑見圖1。

圖1 甲烷氧化菌合成四氫嘧啶的代謝途徑[9]Fig.1 Metabolic pathway of ectoine synthesis by methane-oxidizing bacteria

1 四氫嘧啶的提取

由于甲烷氧化菌在細胞內(nèi)合成四氫嘧啶，在正常條件下不會排放到細胞外，為了得到四氫嘧啶，供工業(yè)生產(chǎn)使用，研究學者使用不同的提取方法來提取菌種胞內(nèi)的四氫嘧啶。提取方法分為兩大類，其中一類方法使用高濃度的有機溶劑改變細胞膜通透性或使其破碎，從而溶解出胞內(nèi)的四氫嘧啶，該方法具有提取率高，提取時間短等優(yōu)勢但會破壞細胞活性，導致細胞無法重復利用。另一類方法，通過改變鹽濃度調(diào)節(jié)細胞外界滲透壓，使細胞自主將四氫嘧啶排泄到細胞外，這種方法提取到的四氫嘧啶純度高，細胞可以反復利用，但該方法提取率較低。在化工生產(chǎn)中可以根據(jù)不同的需要以選用不同的提取方法。近年來國內(nèi)外不同學者使用以下不同的方法提取甲烷氧化菌中的四氫嘧啶。

1.1 有機溶劑法提取四氫嘧啶

St?pniewska 等[10]使用甲醇提取細胞中的四氫嘧啶。在2 000 r/min,4 ℃條件下將細胞培養(yǎng)液離心獲得細胞，使用甲醇以1∶10(V/V)比例抽提細胞中的四氫嘧啶，然后在真空條件下除去甲醇，將干燥的提取液重新溶于水中進行活性炭吸附，用熱乙醇洗脫吸附在活性炭上的四氫嘧啶，得到目標產(chǎn)物。最終四氫嘧啶的提取率大于90%。

蘭州大學龔皎[11]使用甲醇、氯仿、水(體積比為10∶5∶4)的混合溶液來提取四氫嘧啶，取凍干后的菌種，加入甲醇、氯仿、水混合液，劇烈振蕩1 h后離心，收集上清液，溶解出四氫嘧啶其中可能含有溶于混合溶液的雜質(zhì)。將氯仿與水按體積比為1∶1的比例混合，向離心后的上清液中加入氯仿水混合溶液以除去其他雜質(zhì)，劇烈振蕩后離心，收集上清液旋干，收集產(chǎn)物四氫嘧啶。

華中師范大學朱德銳[12]使用乙醇抽提法提取四氫嘧啶，發(fā)酵液離心后收集菌種沉淀，加入80%的乙醇，在70 ℃下旋渦抽提30 min，離心，其沉淀重復以上步驟1次，收集2次離心后的上清液。結(jié)晶后加入與龔皎所使用不同比例的氯仿、乙醇、超純水混合液(體積比為1∶1∶1)溶解結(jié)晶物。旋渦10 min盡可能使四氫嘧啶完全溶于混合溶液中再次離心，沉淀重復以上步驟1次，使提取更完全。收集2次離心后的上清液，再次結(jié)晶后加入體積比為2∶1的氯仿和超純水混合液，旋渦振蕩5 min除去雜質(zhì)離心收集上清液，旋干，得到較純的四氫嘧啶。

乙醇抽提的方法相對以上兩種方法較復雜，但通過反復的溶解，去除不溶性雜質(zhì)使得到的產(chǎn)物純度較高，有利于檢測。

1.2 生物擠奶技術(shù)提取四氫嘧啶

Cantera等[13]使用生物擠奶(bio-milking)技術(shù)提取甲烷氧化菌20Z中的四氫嘧啶,具體分為3個階段：第1階段，在甲烷氧化菌最適鹽濃度下培養(yǎng)菌種，甲烷氧化菌快速增長提高菌種生物量；第2階段，提高培養(yǎng)基的鹽濃度至6%，使甲烷氧化菌在高滲條件下積累四氫嘧啶，將培養(yǎng)一周期的菌液離心收集菌種沉淀；第3階段，將沉淀(菌種)溶于低鹽濃度培養(yǎng)基中，使菌種在低鹽濃度下釋放四氫嘧啶至液體無機鹽培養(yǎng)基中，離心后收集含有產(chǎn)物的上清液，旋干后得到目標產(chǎn)物。將菌體細胞重新放回新鮮的低鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵，重復6次上述“低滲-高滲-低滲”的三段發(fā)酵培養(yǎng)。“生物擠奶”技術(shù)提取率達70%，雖然提取率比有機溶劑法低，但該技術(shù)可以對甲烷氧化菌細胞進行反復的使用，且釋放的四氫嘧啶純度高，最重要的是該技術(shù)安全，整個工藝流程無有害物質(zhì)加入，產(chǎn)品安全可靠。

從甲烷氧化菌中提取的四氫嘧啶經(jīng)過純化達到使用純度后，可應(yīng)用到需要領(lǐng)域的工業(yè)生產(chǎn)中。

2 四氫嘧啶的作用及應(yīng)用

四氫嘧啶可減輕高滲透壓、高溫、凍融、脫水、輻射和化學試劑對蛋白質(zhì)、核酸、生物膜的破壞，使細胞在極端環(huán)境下依然保持活性[14]。高鹽環(huán)境會導致細胞滲透壓升高，在這種環(huán)境條件下，滲透壓變化會導致細胞內(nèi)大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)變性，變性蛋白質(zhì)由于高級結(jié)構(gòu)變化會發(fā)生聚集和沉淀并失去活性[15]。最關(guān)鍵的是四氫嘧啶的存在不會對細胞的整體功能產(chǎn)生任何有害影響，并對細胞保持活力起到積極作用[16]。四氫嘧啶不僅可以高度保水、穩(wěn)定生物分子和整個細胞功能，為大量的耐鹽細菌提供滲透平衡,其亦可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和保證其保持正確的折疊方式[17]。所以四氫嘧啶可以應(yīng)用于多種工業(yè)化生產(chǎn)中細胞的保護，以提高目標產(chǎn)品的產(chǎn)量。由于四氫嘧啶為一種雜環(huán)化合物，所以具有很好的光學活性，故被應(yīng)用于各種化工材料，其已經(jīng)成為化工領(lǐng)域研究的熱點。因此四氫嘧啶可以作為酶、核酸、DNA-Pro復合物[18]。由于四氫嘧啶以上多種作用，現(xiàn)如今四氫嘧啶在化妝品、醫(yī)藥化學等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[19]。

2.1 四氫嘧啶在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用

在美容甚至仿生領(lǐng)域，四氫嘧啶可被用作有效成分被添加到具有保護效果的護膚品中。由于人的皮膚無法避免長時間與外界接觸，輻射、風、濕度、極端溫度等外部因素會導致皮膚老化[20]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶可以保護和穩(wěn)定皮膚細胞的細胞膜，使其免受表面活性劑和導致皮膚脫水應(yīng)激分子的破壞作用[21]，因此四氫嘧啶可以作為一種比甘油更有效的保濕劑，具有長期保濕效果[22]，細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶還可以保護生物分子不變性，如保護DNA免受紫外線的損傷等[23]，因此四氫嘧啶可以用于皮膚防曬[24]，而且四氫嘧啶的抗衰老能力也已經(jīng)在早些年的臨床試驗中得到證實[25]。Sajjad 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，由于四氫嘧啶具有較強的抗腫瘤活性和氧化性，從而能有效中和細胞外輻射誘導產(chǎn)生的自由基，因此四氫嘧啶還可以作為潛在的輻射保護劑。

2.2 四氫嘧啶在醫(yī)藥化學領(lǐng)域的應(yīng)用

在醫(yī)藥領(lǐng)域，由于四氫嘧啶是一種非常有效的淀粉酶抑制劑，所以可以用來治療阿爾茨海默病和海綿狀腦病等由于蛋白質(zhì)錯誤折疊而形成淀粉體導致的疾??；研究表明四氫嘧啶也可以用于HIV病毒感染疾病的治療[27]。此外，四氫嘧啶可以抑制肺病(例如肺氣腫、慢性肺塞性肺病等疾病)[11]。四氫嘧啶可以通過減少細胞凋亡和氧化應(yīng)激誘導的神經(jīng)酰胺中介物，從而有效保護回腸粘膜和肌層。四氫嘧啶有助于特應(yīng)性皮炎恢復[28]，還可以用于治療眼睛，鼻子，皮膚干燥[29]。四氫嘧啶具有消炎作用，Dao 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶可以有效減輕咽炎，在醫(yī)藥領(lǐng)域四氫嘧啶近年來被廣泛應(yīng)用，其經(jīng)濟價值約為1 000元/kg，全球消費量每年15 000 t。

3 總結(jié)與展望

四氫嘧啶在多個領(lǐng)域中的應(yīng)用使得其成為有研究價值的化工產(chǎn)品之一。四氫嘧啶的開發(fā)和利用將成為一個興起的研究領(lǐng)域。除甲烷氧化菌外多數(shù)嗜鹽微生物也可以分泌四氫嘧啶,研究表明，有440種微生物可以自身通過代謝合成四氫嘧啶。例如，長鹽單胞菌(Halomonaselongate)以葡萄糖為碳源，在NaCl濃度為12%的高鹽條件下合成四氫嘧啶，并得到150.5 mg/g高產(chǎn)量的四氫嘧啶[31]。盡管Halomonaselongate生產(chǎn)四氫嘧啶的產(chǎn)量可能比甲烷氧化菌合成的四氫嘧啶產(chǎn)量高，但是該菌生產(chǎn)要求鹽濃度較高，這樣會對儀器造成嚴重的腐蝕，且高鹽濃度使下游的分離提純過程復雜[32]，而甲烷氧化菌在無鹽條件下同樣可以生產(chǎn)四氫嘧啶，并且以甲烷為唯一碳源產(chǎn)四氫嘧啶與以碳水化合物為碳源的菌相比，具有分離提純步驟簡單，環(huán)境友好等優(yōu)勢。甲烷氧化菌亦可以利用生物擠奶技術(shù)，通過反復調(diào)節(jié)外界環(huán)境的滲透壓以刺激菌種，使四氫嘧啶被釋放到細胞外，由于該技術(shù)不影響菌種的活性，菌種可以反復培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法具有較高的經(jīng)濟價值。由于四氫嘧啶在多個領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值，而化學方法難以合成，故將來可能會大量選用生物合成的方法生產(chǎn)四氫嘧啶。研究發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌生產(chǎn)四氫嘧啶具有經(jīng)濟價值高，方法簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)批量生產(chǎn)，但目前在四氫嘧啶對甲烷氧化菌的保護機理以及四氫嘧啶在其他領(lǐng)域的作用機理方面研究成果有限[33]，在這些方面的研究會具有較大的工業(yè)價值。