丁寧，李超，白力，郭美錦,2，莊英萍,2，張嗣良

1 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

2 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237

由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的治療性單克隆抗體 (Monoclonical antibody，MAB) 因其特異性強(qiáng)和耐受性好等特點(diǎn)，已成為最好的治療腫瘤藥物之一[1]。自2018年6月國家藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)“PD-1抗體藥物”在中國上市[2]，抗體藥物已從研發(fā)階段進(jìn)入到大規(guī)模生產(chǎn)和市場(chǎng)應(yīng)用階段，從而使抗體藥物生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸已由抗體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)移到抗體大規(guī)模生產(chǎn)制備技術(shù)，其中由以前的升級(jí)培養(yǎng)規(guī)模放大到千升級(jí)是最關(guān)鍵的制備技術(shù)[3]。因此，適用于大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)性能的生物反應(yīng)器 (Bioreactor) 是核心裝置之一。

生物反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)特性是其使用性能的決定因素，通常有兩種研究方式。一種是實(shí)驗(yàn)方法，如粒子圖像測(cè)速法 (Particle image velocimetry，PIV) 研究方法[1-3]；另一種是計(jì)算流體力學(xué)(Computational fluid dynamics，CFD) 數(shù)值模擬方法[4-7]，即通過模型化和數(shù)值分析對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)特性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法適用于實(shí)驗(yàn)規(guī)模的小型反應(yīng)器研究，且研究方法具有一定的限制，如PIV方法僅適用于單向流或者極低氣含率條件下的流場(chǎng)研究。而CFD方法不受反應(yīng)器大小或操作條件的限制，具有通用性。但CFD方法的主要問題是建模過程中各種模型或模型參數(shù)的選擇對(duì)結(jié)果的影響較大。實(shí)際研究過程中，首先用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模獲得的流場(chǎng)數(shù)據(jù)對(duì) CFD模型進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化，然后用優(yōu)化的CFD模型對(duì)大型或工業(yè)規(guī)模的反應(yīng)器內(nèi)流場(chǎng)特性進(jìn)行分析[8-10]。

在進(jìn)行CFD模擬過程中，影響流場(chǎng)模擬準(zhǔn)確性的因素很多，包括網(wǎng)格大小、湍流模型、兩相間相互作用力模型、氣泡聚并破碎模型等等[11-12]。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，由于生物反應(yīng)器通氣量通常較低，生物反應(yīng)器的流場(chǎng)特性主要由攪拌決定。因此，在模型驗(yàn)證階段，可以用PIV方法獲取的單相流流場(chǎng)數(shù)據(jù)對(duì)CFD結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。如洪厚生等[11]在30 L攪拌罐中研究了4種不同槳葉的流場(chǎng)、剪切率、Kolmogorov尺度和混合時(shí)間，并進(jìn)行PIV實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是，該文只是對(duì)在單層槳體系、不通氣和小體積 (30 L) 特定條件進(jìn)行了考察，而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需要的多攪拌組合條件，即既要滿足反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液混合均勻，又要滿足攪拌系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生盡量小的剪切力，如0.1–0.5 Pa。至今尚未有該方面報(bào)道。

本文根據(jù)我們以前建立的標(biāo)準(zhǔn)k-ε模型[12-13]對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)流場(chǎng)模擬，分析了5種常用的動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)軸流型攪拌槳在通氣條件下的流場(chǎng)特性，確定了用于細(xì)胞培養(yǎng)的最佳攪拌槳組合，并將該型攪拌槳用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程，驗(yàn)證其實(shí)際應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和培養(yǎng)基

中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese hamster ovary cell，CHO 細(xì)胞) 由杭州安普生物公司提供，表達(dá)VEGFR1-Fc-IL-1ra抗體?；A(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基分別為AMP B001和AMP F001。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

分別用設(shè)計(jì)的生物反應(yīng)器進(jìn)行流加批式(Fed-batch) 培養(yǎng)，密度為1×106cells/mL，恒定轉(zhuǎn)速為50 r/min，通過四氣控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)氧分壓，保證過程中溶氧在40%，溫度控制在37 ℃，分別在第7天和第8天流加培養(yǎng)基，速率約為45 mL/d。在培養(yǎng)過程中每24 h取樣一次，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)等分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器攪拌槳和 CFD數(shù)值模擬方法

動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器攪拌槳一般采用軸向流而不是徑向流攪拌槳，前者具有較低的剪切力和良好的混合性能，符合細(xì)胞對(duì)剪切力敏感和懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)。本文選用三窄葉變截面螺旋槳式攪拌器(HBMI3)、四斜葉渦輪攪拌器 (PBT4)、三寬葉螺旋槳式攪拌器 (FBMI3)、三葉大傾角槳式攪拌器(LPBI3) 和二葉大傾角槳式攪拌器 (LPBI2) 為研究對(duì)象，詳細(xì)結(jié)構(gòu)見圖 1。反應(yīng)器底部通過單管進(jìn)行通氣。

圖1 五種機(jī)械軸流式攪拌槳Fig. 1 Five commonly used axial flow impellers. (A)Hydrofoil blade mixing impeller (HBMI3). (B) Pitched blade turbine (PBT4). (C) Fluid foil blade mixing impeller (FBMI3). (D) Large pitched blade impeller(LPBI3). (E) Large pitched blade impeller (LPBI2).

針對(duì)以上常見的5種軸流型攪拌槳，分別模擬了5種雙層攪拌槳組合情況下反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)情況。所采用的流場(chǎng)模擬軟件為 ANSYS CFX 15.0，攪拌槳的旋轉(zhuǎn)采用多重參考系 (Multiple reference frame，MRF) 方法進(jìn)行模擬，計(jì)算網(wǎng)格劃分采用ANSYS ICEM CFD 15.0進(jìn)行，其中槳區(qū)的網(wǎng)格進(jìn)行局部加密，槳區(qū)網(wǎng)格數(shù)約60萬，每個(gè)模型總網(wǎng)格數(shù)約 150萬。計(jì)算模型采用 Euler雙流體氣液兩相模型，湍流模型應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)k-ε湍流模型，采用優(yōu)化的曳力模型對(duì)氣液相間作用力進(jìn)行描述[14-15]。氣泡的分布采用群平衡模型(Population balance model，PBM) 進(jìn)行描述[8]。模型殘差收斂標(biāo)準(zhǔn)為殘差小于10–4且槳葉扭矩和反應(yīng)器內(nèi)的氣含率達(dá)到穩(wěn)定。所模擬的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器幾何尺寸及操作參數(shù)信息如表1所示。

2 結(jié)果與分析

本文采用計(jì)算流體力學(xué) (CFD) 方法對(duì)通氣條件下5種攪拌槳組合在生物反應(yīng)器內(nèi)的流場(chǎng)進(jìn)行數(shù)值模擬，并進(jìn)行CHO細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用驗(yàn)證，結(jié)果如下。

2.1 速度矢量場(chǎng)比較

從圖 2速度矢量場(chǎng)來看，5種攪拌槳組合的流型各不相同。從中可見 PBT4槳組合下速度矢量較為規(guī)整，說明該槳組合流場(chǎng)控制能力較強(qiáng)，主要是由于其葉片較HBMI3號(hào)槳組合要寬，所以表現(xiàn)出較規(guī)整的流型。FBMI3、LPBI3攪拌槳組合有個(gè)共同的特點(diǎn)就是槳周圍大速度梯度范圍較其他槳要大，但是最大速度有所下降。說明這種槳組合的混合能力要好 (槳的影響范圍大)。LPBI2號(hào)槳葉片面積雖然相對(duì)較小，但是也表現(xiàn)出較佳的排出能力，從而形成較為完整的軸向循環(huán)。

表1 模擬采用的反應(yīng)器參數(shù)Table 1 Parameters of bioreactor used in simulation

圖2 不同槳型組合得到的速度矢量圖Fig. 2 Velocity vectors in the bioreactor using different impeller combinations.

2.2 氣含率分布比較

如圖3所示，所試攪拌槳組合的持氣能力都較差，在當(dāng)前操作條件下均表現(xiàn)為氣泛狀態(tài)。這與動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的設(shè)計(jì)原理直接相關(guān)：細(xì)胞對(duì)剪切較敏感，攪拌槳和轉(zhuǎn)速的設(shè)計(jì)過程中需要充分平衡物料混合、細(xì)胞懸浮、剪切和氧傳質(zhì)的關(guān)系。因此設(shè)計(jì)過程中攪拌槳通常只起細(xì)胞懸浮和物料混合的作用，且需控制盡量低的剪切；而氣液傳質(zhì)或氣泡的分散主要通過氣體分布器實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)器內(nèi)氣泡聚并和破碎較少。本文采用的5種軸流槳本身氣體分散能力差，且采用單管通氣，故呈現(xiàn)氣泛特征。

圖3 不同槳型組合得到的氣含率分布圖Fig. 3 Distributions of gas hold-up in the bioreactor using different impeller combinations.

2.3 剪切力比較

表2比較了5種攪拌槳組合形成的流場(chǎng)中平均剪切力與最大剪切力，表明HBMI3攪拌槳組合形成的平均剪切力最小為0.4 Pa，相比較而言FBMI3與LPBI3形成的平均剪切力最大約為0.53 Pa。最大剪切力的比較發(fā)現(xiàn)，LPBI2攪拌槳組合形成的最大剪切力最大為 26.95 Pa，是其他攪拌槳組合的3–8倍，F(xiàn)BMI3攪拌槳組合形成的最大剪切力最小為3.85 Pa。之所以FBMI3與LPBI3形成的最大剪切力較小而平均剪切力相對(duì)較大是由于這兩種攪拌槳在攪拌槳周圍形成的高剪切應(yīng)變率 (速度梯度) 的范圍較大，使得攪拌槳區(qū)的平均剪切力增大造成的，這從剪切力分布云圖 (圖4) 也可證明。

圖4 不同槳型組合得到的剪切率分布圖Fig. 4 Distributions of shear rate in the bioreactor using different impeller combinations.

2.4 CHO細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

將CHO細(xì)胞分別在以上5種生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)15 d，細(xì)胞密度和抗體的表達(dá)水平結(jié)果如表3。CHO細(xì)胞在FBMI3攪拌型式下細(xì)胞密度和抗體表達(dá)水平均最高，其可能原因是該細(xì)胞對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的最大剪切力比較敏感，且在該條件下最大剪切力為 3.853 Pa，比其他攪拌組合明顯小(表2)。因此，細(xì)胞的活率較高，也保證了細(xì)胞正常的生理代謝狀態(tài)，使得表達(dá)外源抗體能力最高。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)最大剪切力約超過6.0 Pa后，細(xì)胞成活率和抗體濃度均顯著降低。本試驗(yàn)CHO細(xì)胞在剪切力26.95 Pa條件下，細(xì)胞的活率下降至75.6%，抗體濃度下降至0.85 g/L。結(jié)果說明CHO細(xì)胞對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的最大剪切力比較敏感，最大剪切過大會(huì)使細(xì)胞生長受損。需指出的是，由于該反應(yīng)器采用的是單管通氣，氣泡直徑較大，而攪拌槳打散氣泡的能力較差 (見圖 3)，因此在反應(yīng)器內(nèi)氣泡聚并和破碎概率較小，且氣泡直徑較大，在其離開液面破碎時(shí)產(chǎn)生的剪切力較小，因此本文通過 CFD模擬并沒有考慮氣泡離開液面破碎時(shí)產(chǎn)生的剪切。

表3 重組CHO細(xì)胞在不同攪拌組合培養(yǎng)結(jié)果Table 3 Growth and EGFR antibody production by CHO cells cultured in bioreactor using different impeller combinations

3 討論

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器已經(jīng)成為現(xiàn)代生物藥物如治療性單克隆抗體和疫苗制備的重要設(shè)備。影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用主要是生物反應(yīng)器流場(chǎng)特性，尤其是對(duì)剪切力(Shear force) 高敏感特性的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞[13-14]。本文對(duì)5種常見的軸流式攪拌槳的5種組合進(jìn)行了CFD數(shù)值模擬，評(píng)估了不同組合下在0.1 vvm通氣率下的生物反應(yīng)器的流場(chǎng)特性，并對(duì)5組攪拌槳組合進(jìn)行了CHO細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)平均剪切率與細(xì)胞生長和抗體的表達(dá)無顯著相關(guān)性，而局部最大剪切力越小的攪拌槳組越有利于細(xì)胞的生長和抗體的高效表達(dá) (表2和表3)。

懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞在攪拌條件下由于在生物反應(yīng)器內(nèi)的運(yùn)動(dòng)而承受較大的剪切力，尤其是經(jīng)過攪拌槳葉尖線速度大而產(chǎn)生的剪切效應(yīng)。最早報(bào)道[16]，只要培養(yǎng)時(shí)表面通氣避免氣泡進(jìn)入和避免氣質(zhì)界面處氣泡的破裂，在攪拌速度100至450 r/min中，三種雜交瘤細(xì)胞系在不同攪拌速度下生長細(xì)胞的存活力和抗體產(chǎn)量是相當(dāng)?shù)?。但是?duì)于工業(yè)規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)如CHO細(xì)胞，細(xì)胞密度通常大于107cells/mL，必須在培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行深層通氣，包括空氣、氧氣和CO2等氣體。當(dāng)氣體通入到培養(yǎng)液時(shí)，氣泡的形成、聚并和破碎將對(duì)過程產(chǎn)生重要影響。當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)流體渦流的不穩(wěn)定性引起氣泡夾帶時(shí)，在200 r/min轉(zhuǎn)速時(shí)可以觀察到細(xì)胞損傷[16]，并且在低轉(zhuǎn)速下其渦流的形成取決于生物反應(yīng)器系統(tǒng)幾何形狀和細(xì)胞懸浮液的體積。Chisti[17]闡明了葉輪類型、直徑、轉(zhuǎn)速和罐直徑等參數(shù)與細(xì)胞損傷的相關(guān)性，并提出了一種在無擋板生物反應(yīng)器中增強(qiáng)混合的方法。通常，細(xì)胞生長的最佳狀態(tài)時(shí)的剪切應(yīng)力數(shù)量級(jí)約為0.1–0.5 Pa，但是，很難通過實(shí)驗(yàn)設(shè)備來直接測(cè)量不同槳葉剪切應(yīng)力，尤其是大規(guī)模生物反應(yīng)器。此外，在實(shí)際的剪切敏感型細(xì)胞的放大過程中，不同細(xì)胞采用的剪切放大參數(shù)可能不同，如最大剪切率、平均剪切率、能量耗散率、EDCF等[14-16,18]，且采用傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算得到的單一剪切參數(shù)通常無法準(zhǔn)確描述反應(yīng)器內(nèi)的真實(shí)剪切環(huán)境[17,19]。而通過數(shù)值模擬方法對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的剪切環(huán)境進(jìn)行全面評(píng)估，并將各剪切參數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以高效確定特定剪切敏感型細(xì)胞放大的關(guān)鍵剪切參數(shù)和剪切閾值，為大規(guī)模生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大提供了一種理性的方法。