張璐，王云龍，李玉林，王繼創(chuàng)，于茵茵，張恒，張怡青，程蕾，張守濤

1 鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450000

2 河南省生物工程技術研究中心，河南 鄭州 450000

3 河南省職工醫(yī)院，河南 鄭州 450000

肝癌是常見的惡性腫瘤，由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，進展迅速，確診時大多數(shù)患者已經(jīng)達到局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，治療困難，預后很差。我國是肝癌高發(fā)國家，慢性乙肝病毒攜帶者基數(shù)龐大，肝癌的早期診斷對于有效治療和長期生存至關重要，因此早發(fā)現(xiàn)早治療成為肝癌防治工作的重點與難點[1]。目前針對肝癌篩查診斷的主要方法有肝穿刺活檢、電子計算機斷層成像 (CT)、磁共振 (MRI或MR)、選擇性肝動脈造影 (DSA) 等。此類方法雖然特異性高，但操作繁瑣，對操作人員要求較高，不易被早期患者所接受[2]。

近年來血清標志物在腫瘤的輔助診斷中起著越來越重要的作用，血清 AFP及其異質(zhì)體是診斷肝癌的重要指標，國內(nèi)常用于肝癌的普查、早期診斷、術后監(jiān)測和隨訪。AFP對肝癌診斷的陽性率一般為60%–70%，容易引起誤診和漏診。李雙喜等[3]研究發(fā)現(xiàn)標志物CKAP4在肝癌組織中高表達。最新研究表明 CKAP4可作為血清診斷標志物[4]，朱錦舟等[5]研究表明對于早期HCC患者CKAP4特異性、敏感性均高于AFP，CKAP4可成為肝細胞癌診斷的血清腫瘤標記物。目前對于CKAP4的檢測方法較少，市面上有商業(yè)化的 ELISA試劑盒，本研究主要研究血清中CKAP4的檢測方法的建立，以期能夠?qū)崿F(xiàn)CKAP4的快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

硝酸纖維素膜 (CN-140)、吸水紙、玻璃纖維棉 (BXM Z80)、PVC底板購自鄭州寶賽生物科技公司；CKAP4參考品 (抗原標定)、CKAP4單克隆抗體、多克隆抗體 (兔 IgG) 由河南省生物工程技術研究中心提供；羊抗兔IgG購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；Eu3+羧基熒光微球購自上海溯源生物；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 購自Sigma公司；HM3030型三維劃膜噴金儀、ZQ2002型微電腦自動斬切機購自上海金標生物科技有限公司；FIC-S2011-D5熒光定量分析儀購自杭州峰航科技有限公司；各類緩沖液等試劑均為國藥化學純；ELISA試劑盒購自CUSABIO公司；臨床血清樣本收集于鄭州大學第一附屬醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1 熒光微球標記物的制備

微球-抗體絡合物制備：吸取40 μL熒光微球加至500 μL硼酸緩沖液 (0.05 mol/L) 中，分別加50 μL EDC (10 mg/mL)、NHS (10 mg/mL)，混勻后超聲5 min，搖床振蕩活化40 min，離心后棄上清，用700 μL硼酸緩沖液 (0.05 mol/L) 重懸顆粒；加入60 μg CKAP4-02抗體，搖床偶聯(lián)2 h，離心后棄上清，加微球保護液 (0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0、1% T-20、0.2% BSA、0.5%酪蛋白、5%海藻糖、0.05%NaN3)，5% BSA加30 μL搖床封閉1 h。

1.2.2 微球墊噴涂

微球墊預處理：使用微球墊處理液 (0.001 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0、3%海藻糖、0.01%甘氨酸、1% T-20、0.05% NaN3) 按照1.5 mL/條比例對微球墊進行預處理，37 ℃干燥2 h。

將制備好的微球-抗體絡合物以5 μL/cm單位量噴涂于預處理的微球墊上，37 ℃過夜干燥。

1.2.3 包被板的制備

將質(zhì)控線抗體及檢測線抗體噴涂與粘貼有NC膜的PVC板上，CKAP4-06抗體作為包被抗體1.5 μg/cm噴涂于T線，羊抗兔IgG 2.5 μg/cm噴涂于C線。

1.2.4 組條

將樣品墊、微球墊、NC膜、吸水紙按順序粘貼于PVC底板上，切裁至4 mm試紙條。

1.2.5 檢測

吸取75 μL的樣品沿試紙條下端2/3處進行滴加，5 min后進行檢測，記錄熒光定量分析儀上的T值、C值。

1.2.6 檢測時間的確定

用濃度為 200 pg/mL的參考品按照現(xiàn)有工藝70 μL/條的加樣量進行點樣，取10個試紙條分別在點樣后 4、6、8、10、12、14、16、18、20 min檢測C值、T值，計算T/C值。

1.3 性能評估

1.3.1 線性范圍

使用CKAP4高值線性參考品1 000 pg/mL進行倍比稀釋 (25、50、100、200、400、800、1 000 pg/mL) 對試紙條進行檢測，以參考品濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標，確定CKAP4試紙條檢測范圍，建立標準曲線。

1.3.2 最低檢出限

采用陰性參考品作為樣品對試紙條進行檢測，共重復檢測20次，根據(jù)所測得結果的T/C值，計算相應的平均值()及標準差 (s)，以陰性參考品和相鄰濃度線性參考品之間的濃度，進行兩點擬合，得出一次線性方程，將x+2s值帶入到上述一次線性方程中，得出試紙條的最低檢出限。

1.3.3 精密度檢測

取3個不同批次制備的試紙條分別檢測3個濃度 (50、200、400 pg/mL) 精密性參考品，每個濃度重復檢測10條，計算批內(nèi)批間的精密度。

1.3.4 準確度測定

通過在陰性樣本中分別添加不同量的 CKAP4參考品，使CKAP4濃度為50、200、400 pg/mL，采用CKAP4熒光免疫試紙條進行檢測，每個濃度重復測定10次，分別計算各濃度回收率的平均值和變異系數(shù)，分析準確度。

1.3.5 特異性

將高濃度的肝癌常用標志物甲胎蛋白、凝血酶原按比例分別添加至 CKAP4參考品中，采用CKAP4熒光免疫層析試紙條進行檢測，測定CKAP4濃度。

1.3.6 穩(wěn)定性

將制備好的試紙條干燥后封裝，置于37 ℃進行加速破壞，使用相同濃度的參考品分別于0、1、3、5、7、14、20 d進行檢測，根據(jù)加速破壞期間T值、C值、T/C值變化，分析試紙條的穩(wěn)定性。

1.3.7 方法學對比

采用本方法制備的試紙條以及商業(yè)化的ELISA試劑盒分別對從醫(yī)院收集的87份臨床血清樣本進行檢測，根據(jù)檢測結果，得出本研究所建立的方法與商業(yè)化ELISA試劑盒的相關性。

1.3.8 臨床評價

采用本研究建立的CKAP4蛋白熒光免疫層析檢測方法制備的試紙條檢測經(jīng)臨床病理確診的肝癌患者樣本67份以及CKAP4陰性樣本45份。

2 結果與分析

2.1 檢測結果判讀

紫外分析儀檢測結果如圖1。C線有熒光，若T線有熒光則為陽性，T線無熒光則為陰性；若C線無熒光，T線有無熒光都判定為試紙條無效或取樣失敗。

2.2 檢測時間的確定

加樣10 min后T/C值趨于平緩，故加樣后10 min為最佳檢測時間，結果見圖2。

2.3 標準曲線的建立

通過使用CKAP4線性參考品進行加樣檢測，結果如圖3所示，CKAP4在25–1 000 pg/mL線性范圍內(nèi)線性較好，y=0.004 2x–0.069 7，R2=0.991 5。

2.4 最低檢出限

圖1 試紙條的判讀Fig. 1 Interpretation of test strips.

圖3 標準曲線的確定Fig. 3 Determination of standard curve.

結果如表1所示，計算20次檢測結果的平均值(= 0 .022)及標準差 (s=0.004)，將()+2s帶入到以陰性參考品和相鄰濃度線性參考品兩點進行擬合得出的一次線性方程 (y=1 893.94×x–41.85)中，求得本研究所建立的CKAP4蛋白檢測試紙條最低檢出限為15 pg/mL。

2.5 精密度

通過制備3批試紙條對3個濃度CKAP4參考品進行檢測，精密性結果見表2，批內(nèi)批間變異系數(shù)均在15%以內(nèi)，符合精密度要求。

2.6 準確度

CKAP4準確度檢測結果見表 3，分別檢測濃度為50、200、400 pg/mL的樣本，其回收率分別為 96.8%、104.71%、105.32%，符合回收率85%–115%的要求。

2.7 特異性

特異性檢測結果見表4，甲胎蛋白與凝血酶原均對CKAP4檢測無影響，特異性較好。

2.8 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性結果見圖4，37 ℃加速20 d，T/C值在1.7左右，試紙條穩(wěn)定性良好。

表1 陰性參考品CKAP4蛋白T/C值檢測結果Table 1 Test result of negative reference CKAP4 protein T/C value

表2 精密度檢測結果Table 2 Precision detection results

表3 準確度檢測結果Table 3 Accuracy detection results

表4 特異性檢測結果Table 4 Specificity detection results

圖4 穩(wěn)定性檢測結果Fig. 4 Stability detection results.

2.9 方法學對比

方法學比對結果見圖5，由結果可知，采用本工藝制備的試紙條商業(yè)化ELISA試劑盒相關性良好，R2=0.986 2。

2.10 臨床評價

檢測結果見表5，本研究建立的CKAP4熒光免疫層析方法檢測肝癌敏感性為 91%，特異性到達100%。

3 討論

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國是肝癌高發(fā)國家，肝癌發(fā)生率、死亡率較高[1]。肝癌的發(fā)生是體內(nèi)多因素、多步驟的復雜過程，且當前肝癌診斷方法不易被早期患者接受，AFP作為當前臨床上原發(fā)性肝癌的血清標志物，在多種腫瘤中均可表現(xiàn)出較高濃度，可作為多種腫瘤的陽性檢測指標，其在肝癌的診斷上只有60%左右的陽性率，如果能找到相對肝癌特異的蛋白或基因，將會對研究肝癌的發(fā)病機制以及提高早期診斷有重要的意義。

圖5 方法學對比結果Fig. 5 Methodological comparison results.

表5 試紙條臨床評價結果Table 5 Clinical evaluation results of test strips

近年來CKAP4成為研究的熱點，CKAP4是一種可逆性棕櫚?；蘑蛐涂缒さ鞍?，最初被發(fā)現(xiàn)是一種主要局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 的蛋白質(zhì)[6]。2016年，Hirokazu等[7]研究表明細胞骨架相關蛋白4 (CKAP4) 是DKK1受體，CKAP4和DKK1的結合打開封閉區(qū)域，當細胞表面膜上存在CKAP4時，DKK1可通過激活PI3K-AKT信號級聯(lián)來促進細胞增殖[6]。李雙喜等[3]研究發(fā)現(xiàn)CKAP4在肝癌組織中高表達，CKAP4在肝癌血清中濃度高于正常，在AFP<10 ng/mL時，CKAP4作為肝癌診斷指標較AFP效能較高，有望作為評估肝癌預后的一項有前景的指標。2018年，Yanagita團隊[4]制備了一種能夠識別血清 CKAP4的單克隆抗體，表明CKAP4是一種新的肺癌早期血清學診斷標志物。2019年，朱錦舟等[5]研究表明HCC患者的判定CKAP4與AFP無明顯差異，早期患者 CKAP4靈敏度、特異性更高，彌補了AFP假陽性高的缺點，提示 CKAP4可作為臨床實踐中HCC早期篩查診斷的血清標記物。

免疫層析試紙作為快速檢測領軍先鋒發(fā)展很快，現(xiàn)今國內(nèi)外免疫層析試紙條技術較成熟應用最廣泛的是膠體金免疫層析試紙條，主要因其操作簡便、快速、特異，適用于廣大基層單位并能在現(xiàn)場作檢測和診斷，目前主要存在的問題是靈敏度相對較低，大多難以實現(xiàn)定量分析[8-9]。熒光免疫層析技術是結合了免疫反應和色譜層析的一項新的診斷技術，既保留了傳統(tǒng)免疫層析技術可現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點，又加入了熒光檢測技術靈敏度高、可定量檢測的特點，近幾年來成為檢驗學和診斷學的研究熱點[10-11]。白亞龍等[12]通過探究量子點與抗體的偶聯(lián)方式以及交聯(lián)劑的比例表明判斷靈敏度比膠體金免疫層析體系高4–20倍。Zhao等[13]通過羧基納米顆粒與抗體偶聯(lián)作為熒光探針，比已報道的酶聯(lián)免疫檢測方法檢測限位低 100倍。Wu等[14]熒光微球免疫層析檢測方法的檢測限更低，準確度、精確度、重現(xiàn)性更好。

本研究通過羧基熒光微球標記抗體建立的熒光免疫層析法對于檢測CKAP4具有快速、準確、靈敏度高等優(yōu)點，且試紙條檢測所需設備小巧便攜，通過電腦連接設備即可即時檢測，檢測時間僅需10 min，操作人員無需接受專業(yè)培訓，單人份成本僅為ELISA的1/10，基本能夠滿足床旁及基層快速診斷的需求。但由于本研究檢測樣本數(shù)較少，后期需加大臨床樣本檢測進行驗證。