肖娟，馬夢琪，梁明星，賀如陽，陳華波

湖北文理學院 醫(yī)學院，湖北 襄陽 441053

基因定點突變是常用的分子生物學技術，是蛋白質(zhì)結(jié)構與功能研究的基礎手段。目前基因定點突變主要采用基于聚合酶鏈式反應 (Polymerase chain reaction，PCR) 的突變引入辦法。最早開發(fā)出來的重疊延伸 PCR (Overlap extension PCR，OE-PCR) 是基因突變的主要方法[1]，近年來還發(fā)展出大引物法與滾環(huán)擴增法等定點突變方法[2-3]。這些方法各有優(yōu)劣，不同實驗室在選擇基因定點突變方法時有所偏好。

OE-PCR包括兩輪擴增，第一輪PCR分別擴增基因上、下游片段，第二輪PCR通過上、下游片段的末端重疊延伸產(chǎn)物作為模板擴增全長基因[4]。很多科研工作者都有類似的經(jīng)驗，即上、下游片段較小時，第二輪PCR容易成功；隨著上、下游基因片段長度增加，第二輪PCR成功率逐漸降低；當某一片段超過2 kb時，第二輪PCR不易獲得目標產(chǎn)物。一般認為是較長的基因片段干擾了上、下游片段的末端互補所致。另一方面，PCR體外擴增DNA時總是存在隨機突變的可能，而且隨著目標產(chǎn)物長度增加，隨機突變的概率也逐漸增加。由于以上兩點，OE-PCR在制作長基因定點突變時往往并不順利。因此，在遇到相應問題時，有科研工作者會轉(zhuǎn)向滾環(huán)擴增法。滾環(huán)擴增法也是目前市場上大多數(shù)突變試劑盒所采用的基本原理，如NEB Q5、Stratagene QuikChange及碧云天 QuickMutation基因定點突變試劑盒等[5-7]。然而，滾環(huán)擴增法也存在固有缺陷：其一，PCR擴增7–12 kb質(zhì)粒依賴于高保真、快速且穩(wěn)定的 DNA聚合酶，否則無法得到目標產(chǎn)物或容易引入隨機突變；其二，若DpnⅠ酶未能對模板質(zhì)粒做徹底消化，則會嚴重干擾目標突變質(zhì)粒的篩選。盡管所有試劑盒廠商都聲稱其所含上述兩酶都滿足要求，但隨著試劑盒使用和存儲時間增加，不可避免的酶活性降低就會極大地影響基因突變的效率。其三，滾環(huán)擴增法還會使目標質(zhì)粒載體序列部分出現(xiàn)突變的風險，因為這部分序列經(jīng)過了PCR擴增，但一般不會測序確認。

我們發(fā)現(xiàn)一般較長的基因內(nèi)往往含有較多常見的限制性酶切位點。對于突變位點兩側(cè)有合適酶切位點的基因突變，仍可采取OE-PCR法擴增其兩側(cè)酶切位點之間的部分序列，再將其連入適當載體即可獲得重組質(zhì)粒。若這兩個酶切位點在質(zhì)粒序列上并不單一，則可以采用雙片段連接法，利用恰當?shù)钠谓M合，亦可得到完整的目標質(zhì)粒。

視網(wǎng)膜母細胞瘤基因 (Retinoblastoma gene 1，rb1) 是典型的抑癌基因[8]，rb1基因缺失與突變是眾多腫瘤發(fā)生的重要誘因[9]。rb1基因轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物約4.7 kb，其開放閱讀框全長2 787 bp，編碼928個氨基酸。在細胞周期的G1期，Rb1蛋白相繼被cyclin D1/CDK4與cyclin E/CDK2磷酸化，釋放與之結(jié)合的E2F，從而啟動G1/S轉(zhuǎn)換[10-12]。Rb1蛋白C端有數(shù)個CDK潛在磷酸化位點，其中大多受cyclin E/CDK2修飾，唯有780Ser是較為可信的 CDK4磷酸化位點[13-14]，將 Rb1蛋白780Ser(S) 突變?yōu)?780Glu(E) 可模擬其磷酸化修飾效果，進而研究其調(diào)節(jié)機制[15]。由于rb1基因編碼區(qū)較長，常規(guī) OE-PCR制作rb1S780E突變體時遇到困難。采用部分擴增與雙片段連接法相結(jié)合，成功克隆了rb1S780E突變體并將其連入質(zhì)粒載體，為進一步研究該基因的調(diào)節(jié)機制做好了基礎準備，同時也提供了一種有效的長基因定點突變解決方案。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α感受態(tài)購自天根生化科技(北京) 有限公司；pEGFP_C3-rb1質(zhì)粒由北京大學生命科學學院張傳茂教授饋贈。

1.2 試劑

2×EasyTaqPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術有限公司；Pyrobest DNA Polymerase、DNA Ligation Kit Ver.2.1 購自 TaKaRa；EcoRⅠ、MluⅠ、NheⅠ、SalⅠ購自NEB；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

引物采用Primer Premier 5. 0軟件設計，由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。引物序列見表1。

1.4 基因克隆

擴增含突變位點的目標基因采用高保真Pyrobest DNA Polymerase。方案如下：總體積20 μL，含 14.3 μL ddH2O，2 μL 10×緩沖液，3 μL dNTPs，0.2 μL 上游引物/0.2 μL 下游引物，0.2 μL 酶，0.1 μL (10 ng) 質(zhì)粒；運行程序：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min ，30個循環(huán)；72 ℃ 1 0 min 。第二輪PCR方案：總體積20 μL，含 13.4 μL ddH2O，2 μL 10×緩沖液，3 μL dNTPs，0.2 μL 上游引物/0.2 μL 下游引物，0.2 μL酶，0.5 μL上游片段/0.5 μL下游片段；運行程序：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 1 0 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至20 μL ddH2O中。酶切方案：取PCR回收物 17 μL，加 2 μL 10×緩沖液，0.5 μLNheⅠ/0.5 μLSalⅠ；另取 pEGFP_C3-rb1質(zhì)粒 3 μg稀釋到 17 μL ddH2O 中，加 2 μL 10×緩沖液、0.5 μLNheⅠ/0.5 μLEcoRⅠ；取 pEGFP_C3-rb1質(zhì)粒 1 μg 稀釋到17 μL ddH2O 中，加 2 μL 10×緩沖液，0.5EcoRⅠ/0.5 μLSalⅠ；37 ℃ 2 h。電泳檢測后將目標片段回收至 20 μL ddH2O 中，用 DNA Ligation Kit Ver.2.1連接：載體0.5 μL，兩個片段各3.5 μL，solutionⅠ7.5 μL 混合，16 ℃ 3 0 min 。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，然后涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.5 菌落檢測與序列分析

在過夜培養(yǎng)的平板上隨機挑取數(shù)個成型菌落，置于4 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，以菌液為模板進行PCR檢測。方案：5 μL 2×SuperMix，0.1 μL 上游引物/0.1 μL 下游引物，0.8 μL菌液，補水至10 μL；擴增條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，30個循環(huán)。另對部分克隆取3 mL菌液小量提取質(zhì)粒進行酶切檢測，方案為：12.5 μL ddH2O，2 μL 10×緩沖液，0.5 μL 內(nèi)切酶，5 μL 小提質(zhì)粒；37 ℃2 h。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物皆經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。取2個經(jīng)驗證的陽性質(zhì)粒進行序列測定，質(zhì)粒測序由北京天潤奧科生物科技有限公司完成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方案下目標突變體的擴增

欲制作rb1S780E定點突變，需將rb1基因編碼區(qū) 2 338–2 339 位“TC”突變?yōu)椤癎A”。考慮到該基因較長，采用常規(guī)OE-PCR法可能不易得到理想的第二輪PCR產(chǎn)物。對rb1作限制性酶切分析，發(fā)現(xiàn)目標突變位點 S780E上游 470 bp處有一個NheⅠ位點，另上游1 438 bp處有一個EcoRⅠ位點 (圖1A)。因此，可以僅對rb1_F2 (900–2 787)或rb1_F3 (1 968–2 787) 部分做OE-PCR擴增，再利用NheⅠ或EcoRⅠ酶切位點將該片段連入載體構建完整的突變體質(zhì)粒。為尋找最佳解決方案，依上述思路按OE-PCR定點突變法進行對比操作。

以原始質(zhì)粒 pEGFP_C3-rb1為模板，分別以S0、S1、S2搭配780E_A為引物擴增上游片段，以780E_S/pEGFP_C3′為引物擴增下游片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，得到4個預期大小的DNA片段 (圖 1B)。在第二輪 PCR時，發(fā)現(xiàn)上游片段 a與下游片段 d組合未能擴增出全長rb1，上游片段b與下游片段d組合擴增出的產(chǎn)物主帶不明，且雜帶較多；而上游片段c與下游片段d組合擴增出預期的目標產(chǎn)物片段。經(jīng)多次調(diào)整PCR反應條件，仍未能得到理想的全長rb1產(chǎn)物及F23片段。以上結(jié)果說明OE-PCR時較長片段不易重疊延伸而擴增出目標產(chǎn)物，與經(jīng)驗相符。

2.2 目標質(zhì)粒的雙片段連接

理論上，將上述#3產(chǎn)物以NheⅠ/SalⅠ雙酶切即可得到rb1_F3片段，再連接到切除對應片段的載體即可得到完整的突變體質(zhì)粒。然而，限制性酶切分析發(fā)現(xiàn)原始質(zhì)粒多克隆位點上游還有另一個NheⅠ位點，因此F3片段無法直接與載體連接得到目標質(zhì)粒。盡管如此，可采用雙片段連接法解決上述問題。即以NheⅠ/EcoRⅠ雙酶切原始質(zhì)粒獲得rb1_F2 (900–1968)片段，以NheⅠ/SalⅠ雙酶切#3 PCR產(chǎn)物獲得F3片段，將上述兩個片段一起與經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ酶切的質(zhì)粒載體部分連接，從而得到完整目標質(zhì)粒 (圖2)。

圖1 OE-PCR擴增含突變位點的基因片段Fig. 1 Amplification of the gene fragments containing target mutation by OE-PCR. (A) rb1 gene map and primers position.(B) Agarose gel electrophoresis of the first round of PCR. The upstream primers for lane ‘a(chǎn)’ to ‘c’ were S0, S1, S2 respectively and all of their downstream primer was 780E_A. The primers for lane ‘d’ were 780E_S/pEGFP_C3′. (C) Agarose gel electrophoresis of the second round of PCR. The template for #1 to #3 were mixture of product a&d, b&d, c&d, respectively.The template for ‘+’ was pEGFP_C3-rb1 plasmid. The upstream primers for group 1 to 3 were S0, S1, S2 respectively and all of their downstream primer was pEGFP_C3′. M stands for DNA marker.

上述#3 PCR產(chǎn)物雙酶切簡單易行 (圖3 a泳道)。將原始質(zhì)粒以NheⅠ/EcoRⅠ雙酶切，得到1 068 bp、1 662 bp、4 773 bp三個片段，其中最小的片段即所需的F2片段，它與1 622 bp片段相距較遠，容易分離回收 (圖3 b泳道)。將原始質(zhì)粒以EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切可得到1 888 bp、5 615 bp兩個片段，其中大片段即所需的載體部分 (圖3 c泳道)，它含有rb1_F1 (1–900) 部分。

圖2 雙片段連接示意圖Fig. 2 The diagram of double fragments ligation. F2 (yellow line) and F3 (red line) are ligated with vector, which contain F1 (purple line), to obtain the complete plasmid. Color dots represent different restriction sites and black dot represents the target mutation site.

圖3 基因片段及載體的限制性酶切Fig. 3 Restriction enzymatic digestion of gene fragments and vector. Agarose gel electrophoresis of the OE-PCR product #3 digested by NheⅠ/SalⅠ (lane a),and pEGFP_C3-rb1 plasmid digested by NheⅠ/EcoRⅠ(lane b) or EcoRⅠ/SalⅠ (lane c). M stands for DNA marker. DNA fragments that need to be retrieve from gel were encircled by an ellipse.

2.3 目標質(zhì)粒的檢測與鑒定

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后經(jīng)卡那霉素選擇性平板培養(yǎng)基篩選，得到數(shù)十個菌落 (圖4A)，明顯少于本實驗室單片段連接時的菌落形成數(shù)[16]。從中任意挑取8個菌落，經(jīng)適當培養(yǎng)后進行檢測、鑒定。以兩種不同的引物組合進行PCR檢測，方案一選用S2/780E_A引物組合；陽性結(jié)果表示質(zhì)粒含有rb1基因后半部分 (圖4B)。檢測得到#1、#4、#5三個陽性克隆，其產(chǎn)物大小約500 bp，與預期 (514 bp) 相符 (圖 4C)。方案二選用780E_S/pEGFP_C3′引物組合；陽性結(jié)果表示質(zhì)粒為pEGFP_C3載體，且含有rb1后半部分。該方案檢測結(jié)果與方案一一致，其產(chǎn)物大小約400 bp，與預期 (421 bp) 相符 (圖4D)。為進一步確認檢測結(jié)果的可靠性，對#1–5號克隆提取質(zhì)粒作酶切檢測。分別以MluⅠ與NheⅠ作單酶切檢測，結(jié)果顯示#1、#4、#5這3個質(zhì)粒能切出預期片段，而#2、#3號質(zhì)粒無預期片段 (圖4E，F(xiàn))。酶切檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致。

為鑒定目標質(zhì)粒序列準確性，對其中#1、#4陽性質(zhì)粒進行序列測定。由于經(jīng) PCR擴增的 F3片段位于基因下游，且目標突變位點S780E距下游SalⅠ位點僅490 bp，故選擇pEGFP_C3′引物對該質(zhì)粒反義鏈進行序列測定。結(jié)果顯示兩者目標位點為TC堿基，且F3部分序列內(nèi)未引入其他非預期突變點 (圖5)。表明其正義鏈對應位置為GA堿基，符合預期的rb1S780E突變體序列特征。由于目標質(zhì)粒其他部分未經(jīng)PCR擴增，故未作序列測定。綜合分析，#1、#4克隆皆是符合要求的pEGFP_C3-rb1S780E目標突變體。

圖4 陽性克隆的篩選Fig. 4 Screening positive colonies. (A) Bacterial colonies on plate. (B) The position of the primers and restriction enzymes which were used for detection of positive colonies. Agarose gel electrophoresis showed the results of PCR with S2/780E_A primers (C) or 780E_S/pEGFP_C3′ primers (D) and the restriction enzymatic digestion results with Mlu I (E)or Nhe I (F). –/+ stand for negative/positive control, #1–8 stand for the selected colony and M stands for DNA marker.Expected fragment sizes were showed at the bottom of each figure.

圖5 陽性質(zhì)粒的關鍵序列Fig. 5 Sequence of the positive plasmids. (A) Amino acid and nucleotide sequence of target mutant. Peak trace of antisense of plasmid #1 (B) and #4 (C). Critical sequences of mutant position were encircled by square frame.

3 討論

長片段干擾重疊延伸效率是制約OE-PCR應用于長基因定點突變的重要因素；另一方面，制作長基因突變體時，往往得到了預期定點突變，卻引入了新的非預期突變 (圖6A)。滾環(huán)擴增法在一定程度上可以解決長基因定點突變的問題，但其也存在其他固有缺陷。若仍以 OE-PCR制作長基因定點突變，則僅擴增含突變位點的部分基因序列成為克服上述困難的良好解決方案。一則 OE-PCR擴增較短的基因片段成功率較高，二則擴增短基因片段時引入非預期突變的幾率相對較小 (圖6B)。

采取部分擴增結(jié)合酶切-連接法制作長基因定點突變要求突變位點兩側(cè)附近皆有合適的酶切位點，以便于將擴增的基因片段重新連入載體獲得完整目標質(zhì)粒。最理想的情況是其兩側(cè)附近各有一個單一酶切位點，此時按常規(guī)基因克隆方法即可重新連接得到完整目標質(zhì)粒。然而往往遇到另外一種情況，即突變位點兩側(cè)雖有酶切位點，但它們在目標質(zhì)粒上并不單一。如本例中目標位點S780E上游雖有一個NheⅠ位點，但載體序列本身還有另一個NheⅠ位點。若以NheⅠ/SalⅠ酶切原始質(zhì)粒再連接擴增基因片段，則目標質(zhì)粒將丟失rb1基因上游大部分序列。對于這種情況，雙片段連接法是一個很好的解決方案：本例中兩個片段同時與一個載體連接的辦法成功避開了雙NheⅠ位點對片段連接的限制 (圖2)。該方案所獲得的完整質(zhì)粒中基因上游F1部分與中部F2皆源自原始質(zhì)粒，一般認為序列忠實，不會出現(xiàn)新的突變 (圖 6B)。唯一存在隨機突變可能的只有經(jīng)PCR擴增的F3部分，只對這部分DNA進行序列測定即可判斷目標質(zhì)粒的準確性。

圖6 常規(guī)OE-PCR與部分擴增法的比較Fig. 6 Comparison of two protocols. (A) In conventional protocol, it is difficult to get target product by OE-PCR with long upstream and/or downstream fragments. (B) It is relatively easy to amplify a short DNA fragment containing mutation site. Red lines indicate that there may be unexpected mutations in DNA fragments which were amplified by PCR.

結(jié)合實際工作經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)相對常規(guī)單片段連接方案，雙片段連接時得到的轉(zhuǎn)化克隆數(shù)較少，且陽性率偏低；調(diào)整連接體系中兩片段和載體的比例可適當提高轉(zhuǎn)化克隆數(shù)。本例中平板上只形成數(shù)十個菌落，檢測陽性率只有 37.5%，都低于本實驗室常規(guī)方案下的經(jīng)驗值。盡管如此，若常規(guī)OE-PCR難以解決某些長基因定點突變問題時，本方法不失為一種有效的解決方案。