王鑫怡，肖曉藝，孫暢，王菲

西南大學 生物學研究中心，重慶 400716

無脊椎動物和脊椎動物在長期進化過程中形成了非常保守的先天免疫系統(tǒng)[1]。兩者在先天免疫信號途徑中存在諸多同源分子，它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征、作用特點和調(diào)控方式。而果蠅作為昆蟲先天免疫研究的模式生物，闡明其先天免疫信號通路中關(guān)鍵蛋白的分子作用機理，有助于更清楚地了解昆蟲先天免疫信號通路中的調(diào)節(jié)機制，對研究其他物種的免疫調(diào)控具有重要參考意義。

病原微生物入侵時，昆蟲體內(nèi)的多層防御機制被激活，主要包括細胞免疫和體液免疫[2]。細胞免疫由血淋巴細胞介導(dǎo)，依賴吞噬和包裹清除入侵的病原體[3]。體液免疫主要涉及抗菌肽 AMPs(Antimicrobial peptide) 和黑化因子的產(chǎn)生，昆蟲脂肪體產(chǎn)生并分泌AMPs到血淋巴中，裂解殺死細菌；黑化因子沉積在入侵者的周圍，形成黑色素囊包裹入侵者并將其殺死[4]。果蠅體液先天免疫應(yīng)答主要受兩條NF-κB信號通路——Toll和IMD信號通路調(diào)控[5]。Toll通路主要抵御革蘭氏陽性菌和真菌，產(chǎn)生Drosomycin等抗菌肽[6]；而IMD通路主要感知大多數(shù)革蘭氏陰性菌及少數(shù)具有內(nèi)消旋-二氨基庚二酸型肽聚糖 DAP-type PGN (Diaminopimelic acid-type peptidoglycan) 的革蘭氏陽性菌的感染，產(chǎn)生Attacin、Diptericin等抗菌肽。在IMD信號通路中，跨膜受體 PGRP-LC或膜內(nèi)受體 PGRP-LE識別 DAP-型 PGN，招募膜內(nèi)銜接蛋白 IMD(Immune deficiency)，IMD進一步招募配體蛋白FADD (Fas-associated death domain-containing protein) 與Dredd (Death-related ced-3/Nedd2-like protein)，促使Dredd活化，活化的Dredd特異性切割I(lǐng)MD和NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子Relish，切割后的IMD結(jié)合E3泛素化連接酶DIAP2發(fā)生泛素化[7-8]，招募TAK1和IKK[9]，磷酸化切割后的Relish，Relish具有轉(zhuǎn)錄活性的N端進入細胞核，激活A(yù)MPs的表達[10-11]。

果蠅FADD (dFADD) 是哺乳動物FADD的同源物，其N端具有一個DED結(jié)構(gòu)域 (Death-effector domain)，C端包含一個DD結(jié)構(gòu)域 (Death domain)。在IMD信號通路中，dFADD分別通過其DD結(jié)構(gòu)域和 DED結(jié)構(gòu)域與上游同樣包含 DD結(jié)構(gòu)域的IMD和下游同樣包含DED結(jié)構(gòu)域的Dredd相互作用，調(diào)控抗菌級聯(lián)信號的傳遞[12-14]。然而，目前關(guān)于dFADD的研究僅限于功能，其潛在的作用機制仍不清楚。研究報道，在IMD信號通路中，果蠅PGRP-LC、PGRP-LE和IMD能夠形成功能性淀粉樣蛋白纖維聚合物，且該淀粉樣蛋白纖維是 IMD信號傳遞所必需的[15]。最近，本研究團隊發(fā)現(xiàn)家蠶Dredd也能形成功能性蛋白聚合物[16]。

為進一步深入研究dFADD在IMD信號通路中的作用機制，本研究擬通過ThT染料結(jié)合、透射電鏡觀察等鑒定原核表達純化的 dFADD蛋白在體外能否形成淀粉樣蛋白纖維；通過共聚焦顯微鏡觀察、ThT染色以及 SDD-AGE檢測等方法在細胞水平上鑒定 dFADD是否在細胞內(nèi)形成淀粉樣蛋白纖維聚合物；通過構(gòu)建結(jié)構(gòu)域突變體，鑒定纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域以及在IMD信號傳遞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

果蠅S2細胞系衍生自胚胎，由本實驗室保存,在27 ℃條件下，培養(yǎng)在添加10%胎牛血清 (非熱滅活) 和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的Schneider’sdrosophilamedium (Gibco) 中。

Tubulin抗體、HRP標記山羊抗鼠抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、NP-40裂解液、DAPI染色液、蛋白酶抑制劑PMSF等購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HA標簽單克隆抗體購自Invitrogen；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準購自 Thermo Scientific；DAP-型PGN購自Sigma；細胞轉(zhuǎn)染試劑購自 Roche；BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞、Trans-T1噬菌體抗性化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；超純質(zhì)粒試劑盒購自Qiagen；點突變試劑盒購自TaKaRa；pCold-Sumo載體購自 Hai gene；ThT試劑購自 Santa Cruz；Dual-Glo雙熒光素酶活檢測試劑購自Promega。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

原核表達質(zhì)粒 pCold-Sumo-dFADD及真核表達質(zhì)粒pMT/V5-HisA-HA-dFADD、pMT/V5-HisAHA-dFADD-mCherry的構(gòu)建均根據(jù) NCBI檢索到的各個基因的CDS序列設(shè)計引物并擴增出正確片段克隆至相應(yīng)載體上，dFADD結(jié)構(gòu)域突變體的構(gòu)建根據(jù)點突變試劑盒使用說明，以上序列均送深圳華大基因股份有限公司測序。本研究所用引物如表1所示，所構(gòu)建載體圖譜如圖1所示。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將細胞進行血球計數(shù)板計數(shù)后接種至12孔細胞板 (1×105個細胞/孔)，待細胞生長至對數(shù)生長期，0.5 μg/孔的質(zhì)粒與1 μL/孔的脂質(zhì)體混合孵育15 min，轉(zhuǎn)染至細胞中，5 h后進行CuSO4誘導(dǎo) (終濃度為 500 μmol/L)，24 h后收集細胞用于SDD-AGE檢測或制備細胞爬片。以上轉(zhuǎn)染均使用分光光度計對轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒進行定量。

1.4 細胞爬片的制備及ThT染色

將細胞舊培養(yǎng)基吸凈棄之，添加500 μL 3%多聚甲醛 (PFA) 固定細胞20 min，PBS輕輕地沖洗一次，添加 500 μL 0.3% Triton-X100，靜置 20 min，添加3 mmol/L ThT搖晃染色20 min (避光操作)，70%乙醇清洗3次/min，PBS清洗3次，每次3 min，添加500 μL DAPI染色液，靜置5 min，PBS清洗3次，每次3 min，向載玻片上滴加3 μL抗熒光淬滅封片液，夾起細胞爬片置于封片液上，于4 ℃避光保存。dFADD點狀分布和彌散分布細胞數(shù)量的統(tǒng)計執(zhí)行3個孔的重復(fù)。每個重復(fù)隨機選取5個視野，計數(shù) (200±5) 個細胞。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

圖1 dFADD的原核和真核表達載體圖譜Fig. 1 Prokaryotic and eukaryotic expression vector maps of dFADD. Black line: restriction enzyme cutting site; black box: dFADD ORF; dark grey box: sequence encoding His-Sumo; white box: sequence encoding HA tag;light grey box: sequence encoding mCherry.

1.5 原核表達純化蛋白及ThT結(jié)合實驗、透射電子顯微鏡觀察

將表達pCold-Sumo-dFADD質(zhì)粒的菌液于1 L LB氨芐液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD值為0.4–0.6，添加 0.1 mmol/L 的 IPTG，15 ℃、220 r/min誘導(dǎo)蛋白表達24 h。6 000 r/min、4 ℃離心20 min收菌，用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L β巰基乙醇，5%甘油，1 mmol/L PMSF的緩沖液重懸菌沉淀，超聲破碎7 min 30 s，4 ℃、16 000 r/min離心45 min，收集蛋白上清，掛鎳柱，再用不同濃度梯度的咪唑?qū)⑵湎疵摚琒DS-PAGE鑒定蛋白大小及純度。對目標蛋白濃度最高的洗脫液脫鹽處理，Sumo酶酶切30 ℃、1 h，反掛鎳柱，收集流穿液，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，BCA測定蛋白濃度。

ThT結(jié)合實驗：用10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4) 將純化的 dFADD稀釋至反應(yīng)終濃度為32 μmol/L，ThT反應(yīng)終濃度為 25 μmol/L，再將dFADD進行不同程度的梯度稀釋，陽性對照為Aβ蛋白，陰性對照為BSA蛋白，分別將各蛋白樣品于37 ℃、1 000 r/min孵育24 h，孵育體積不少于400 μL。隨后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至96孔黑色酶標板，添加新鮮配制的ThT溶液，搖晃孵育15 min，上機檢測：固定激發(fā)光為440 nm，檢測470–600 nm不同發(fā)射光的熒光強度。

透射電子顯微鏡觀察：吸取終濃度為37 μmol/L的蛋白樣品滴加于銅網(wǎng)格上，吸附1 min，風干，用2%乙酸鈾酰水溶液負染45 s，去除多余染液，風干，透射電鏡觀察，電壓200 kV。

1.6 SDD-AGE

凝膠制備：1×TBE配制含0.1% SDS的1.5%瓊脂糖凝膠。樣品制備：將細胞裂解物 (細胞裂解液：NP-40裂解液+1 mmol/L DTT+2 mmol/L PMSF)與蛋白上樣緩沖液 (配制4×母液：2×TBE，20%甘油，8% SDS，0.2%溴酚藍，室溫保存，使用終濃度為1×) 混合，37 ℃孵育5 min，蛋白上樣總量為80 μg。電泳：水平凝膠電泳 (電泳緩沖液：1×TBE+0.1% SDS)，恒壓3 V/cm (凝膠寬度)，于4 ℃冰箱中進行。毛細管轉(zhuǎn)膜：由下往上依次放置：5 cm干濾紙、一層轉(zhuǎn)膜緩沖液 (1×TBS) 浸濕濾紙、PVDF膜、凝膠、一層浸濕濾紙、一層浸濕濾紙橋。室溫靜置 9 h。轉(zhuǎn)膜完成后，執(zhí)行標準的 Western blotting檢測。

1.7 雙熒光素酶檢測

將舊培養(yǎng)基吸凈棄之，添加300 μL PBS重懸細胞于 1.5 mL離心管，10 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸取120 μL Dual-Glo雙熒光素酶活檢測試劑重懸細胞，室溫搖晃裂解 15 min，吸取 50 μL至96孔黑色酶標板，用GloMax-Multi微孔酶標儀讀數(shù)。取出酶標板，吸取50 μL終止反應(yīng)檢測試劑加入對應(yīng)孔中，搖晃混勻 10 min，使用酶標儀讀數(shù)。本實驗采用海腎熒光素酶質(zhì)粒作為內(nèi)參。每個樣品取 3個孔的重復(fù)，數(shù)據(jù)用±s表示，并通過ANOVA單因素方差分析后采用鄧肯氏 (Duncan)新復(fù)極差測驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 dFADD在體外形成淀粉樣蛋白纖維聚合物

采用帶有His-Sumo標簽的pCold-Sumo載體原核表達純化His-Sumo-dFADD，該蛋白在200 mmol/L咪唑濃度下被大量洗脫 (圖 2A)，隨后使用 Sumo酶切除His-Sumo標簽，得到大小為27 kDa的蛋白dFADD (圖 2B)。分別使用灰度計算軟件Image J及BCA蛋白濃度測定法對該蛋白的純度和濃度進行分析，結(jié)果表明，dFADD純度和濃度分別約為96.2%和 37 μmol/L，可進行后續(xù)實驗。硫黃素 T(ThT) 是一種淀粉樣蛋白纖維聚集體的特異性熒光染料。ThT與淀粉樣蛋白纖維結(jié)合后，光譜性質(zhì)發(fā)生變化，激發(fā)波長從335 nm增加至445 nm，發(fā)射波長由400 nm增加至485 nm。ThT結(jié)合實驗表明，dFADD能夠與ThT染料特異性結(jié)合，改變ThT的光譜性能，使其在440 nm的激發(fā)光下，在發(fā)射波490 nm處產(chǎn)生與陽性對照——典型的β淀粉樣蛋白Aβ一樣的峰值 (圖2C)，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。純化的dFADD蛋白在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象 (圖2D)，dFADD發(fā)生明顯聚集，但大多數(shù)為無定形聚集 (如白色箭頭所示)，只有少數(shù)部分能夠聚合形成較大的聚集體 (如黃色箭頭所示)，且該聚集體整體呈現(xiàn)為纖維狀。綜上所述，dFADD在體外可聚集形成淀粉樣蛋白纖維聚合物。

圖2 dFADD的原核表達純化、ThT結(jié)合及透射電子顯微鏡觀察Fig. 2 Prokaryotic expression and purification, ThT binding and transmission electron microscopy of dFADD. (A) Imidazole concentration gradient elution of dFADD. 1: supernatant; 2: sedimentation; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 300 mmol/L; 11: 500 mmol/L; 12: 800 mmol/L; 13: 1 mol/L;M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD. (B) The imidazole concentration gradient elution of dFADD after digested by Sumo enzyme. 1: uncut; 2: after digestion; 3: flow through; 4: 0 mmol/L; 5: 10 mmol/L; 6:20 mmol/L; 7: 50 mmol/L; 8: 100 mmol/L; 9: 200 mmol/L; 10: 500 mmol/L; M: protein pre-stained marker (kDa); black arrowhead: His-Sumo-dFADD; brown arrowhead: dFADD; blue arrowhead: Sumo enzyme; gray arrowhead: His-Sumo. (C)ThT binding assay of dFADD. (D) Transmission electron microscopy of dFADD. White arrowhead: amorphous aggregation of dFADD; Yellow arrowhead: amyloid fiber aggregates of dFADD.

2.2 dFADD在細胞內(nèi)形成淀粉樣蛋白纖維聚合物

為探究dFADD在體內(nèi)是否形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，模擬在體外培養(yǎng)果蠅S2細胞中過表達dFADD-mCherry融合蛋白，通過共聚焦顯微鏡觀察 dFADD的細胞定位及分布情況，發(fā)現(xiàn) dFADD在果蠅 S2細胞中呈現(xiàn)兩種分布：一種呈點狀(圖3A)，此種形式數(shù)量較少，但其熒光強度較亮；另一種則彌散分布于整個細胞質(zhì)中，熒光強度較弱一些 (圖3B)。在果蠅IMD信號通路中一些能夠形成淀粉樣蛋白纖維聚合物的蛋白，如 PGRP-LC等也呈現(xiàn)這樣的點狀聚集形式[15]，因此推測這種點狀分布的dFADD可能也是蛋白聚合體。為排除蛋白聚集是由于過量表達所造成的，同時轉(zhuǎn)染了等量的mCherry蛋白表達載體 (圖3C)，該蛋白均勻分布于細胞中，證實過量表達不會造成蛋白的聚集。

圖3 dFADD的熒光觀察、ThT染色及SDD-AGE檢測Fig. 3 Fluorescence observation, ThT staining and SDD-AGE detection of dFADD. (A) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry. (B) Diffuse distribution of dFADD-mCherry. (C) Diffuse distribution of mCherry. (D) Puncta-like distribution of dFADD-mCherry specifically binds to ThT. (E) Diffuse distribution of dFADD-mCherry does not specifically bind to ThT. (F) SDD-AGE detection of HA-dFADD.

對過表達dFADD-mCherry蛋白的S2細胞進行 ThT染色，經(jīng)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)點狀分布的dFADD與ThT綠色熒光重疊，表明其能夠與ThT特異性結(jié)合，這些點狀物即為淀粉樣蛋白纖維聚合物 (圖3D)。相反，彌散分布的dFADD則未呈現(xiàn)出ThT綠色熒光 (圖3E)，表明其未發(fā)生聚合。這些結(jié)果表明 dFADD在細胞內(nèi)部分形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，這與電鏡觀察的結(jié)果一致。SDD-AGE是一種半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，該技術(shù)SDS用量少，基本不破壞聚集體，并借助疏松網(wǎng)狀的瓊脂糖凝膠進行大分子蛋白的遷移。本研究通過SDD-AGE檢測過表達HA-dFADD的S2細胞裂解物，發(fā)現(xiàn)HA-dFADD在細胞內(nèi)以單體與聚合物共存 (圖3F)。

2.3 DED結(jié)構(gòu)域是dFADD纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

為探究dFADD淀粉樣蛋白纖維的形成與哪一個結(jié)構(gòu)域有關(guān)，構(gòu)建了刪除dFADD結(jié)構(gòu)域的真核表達載體 (圖4A)，SDS-PAGE檢測各突變體蛋白成功表達 (圖 4B)。隨后對 dFADD-WT及其突變體進行 SDD-AGE檢測，結(jié)果顯示，dFADD-WT存在聚合物和單體兩種形式，且單體量較高；dFADD-ΔDED 僅以單體形式存在；dFADD-ΔDD則表現(xiàn)出單體明顯減少、聚合物明顯增多的特征(圖4C)。熒光觀察結(jié)果顯示，dFADD-ΔDD在細胞內(nèi)具有聚集和彌散兩種分布，其聚集形式能夠被ThT染色，呈現(xiàn)綠色熒光；而dFADD-ΔDED僅有彌散分布一種形式，不能與ThT結(jié)合 (圖4D、E)。同時對dFADD及其突變體的聚集形式和彌散形式的比例進行了統(tǒng)計 (圖4F)，dFADD-WT的聚集比例為 19.23%，dFADD-ΔDED 的聚集比例為 0，dFADD-ΔDD的聚集比例為 31.77%。此外，PGN刺激后，dFADD-WT和dFADD-ΔDD的聚集比例均有所上升，分別為24.10%和38.22%。以上結(jié)果均表明，DED結(jié)構(gòu)域是dFADD纖維形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，且PGN刺激能夠誘導(dǎo)更多dFADD聚集。

2.4 dFADD纖維形成是IMD信號傳遞的關(guān)鍵

為進一步探究dFADD形成的淀粉樣蛋白纖維在IMD信號通路中的作用，在細胞中表達dFADD或其突變體，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對抗菌肽Attacin和 Diptericin的誘導(dǎo)水平進行了檢測。結(jié)果顯示，在 PGN刺激下，dFADD-ΔDED對抗菌肽的表達無促進作用，或遠低于 dFADD-WT和dFADD-ΔDD；而蛋白聚合比例較高的dFADD-ΔDD，促進抗菌肽表達的作用則高于dFADD-WT (圖 5A、B)。以上結(jié)果表明，dFADD淀粉樣蛋白纖維的形成是IMD信號通路傳遞的關(guān)鍵，是誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生所必需的。

3 討論

淀粉樣蛋白聚集體最早被發(fā)現(xiàn)與人類淀粉樣蛋白疾病有關(guān)。某些蛋白或多肽錯誤折疊并形成淀粉樣蛋白纖維，在器官和組織的胞外空間中沉積，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，例如Aβ蛋白導(dǎo)致的阿爾茨海默氏癥，阮病毒蛋白導(dǎo)致的海綿狀腦病，α核蛋白導(dǎo)致的帕金森病等[17]。然而，近年來從細菌到昆蟲再到人類，逐漸發(fā)現(xiàn)一些功能性淀粉樣蛋白纖維，它們并不導(dǎo)致疾病發(fā)生，而是在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理功能，例如PMEL形成淀粉樣纖維作為支架沉積和儲存哺乳動物黑色素；熒光假單胞菌的FapC組成的原纖維有助于生物膜的形成和穩(wěn)定；生殖特異性胱抑素蛋白Cst8在體外形成淀粉樣蛋白原纖維，在精子成熟或維持管腔環(huán)境中發(fā)揮作用[18-20]。對哺乳動物信號傳導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，RIPK1和RIPK3的RIP同型相互作用基序RHIMs介導(dǎo)了其異二聚體絲狀結(jié)構(gòu)的組裝，二者形成淀粉樣蛋白纖維復(fù)合物，在誘導(dǎo)細胞程序性壞死的信號通路中是不可或缺的[21-23]。與此相似的是，在昆蟲的IMD免疫信號通路中，PGRP-LC、PGRP-LE、IMD三種蛋白形成功能性淀粉樣蛋白纖維聚合物，PGRP-LC或PGRP-LE首先聚合形成淀粉樣蛋白原纖維，成為下游IMD纖維聚合的核心，促進IMD的聚合，纖維形成是IMD通路的信號傳遞所必需的[15]。這暗示著對于哺乳動物和昆蟲，信號分子的組織形式和信號傳遞方式具有進化上的保守性。dFADD纖維參與IMD級聯(lián)調(diào)控的分子作用尚需要后續(xù)深入研究。

圖4 dFADD-WT及其突變體真核表達載體的構(gòu)建、SDD-AGE檢測及熒光觀察Fig. 4 Eukaryotic expression vector construction, SDD-AGE detection and fluorescence observation of domain-deleted mutants of dFADD. (A) Schematic diagram of dFADD-WT and its domain-deleted mutants. (B)SDS-PAGE detection of dFADD-WT and its mutants. M: protein pre-stained marker (kDa). (C) SDD-AGE detection of dFADD-WT and its mutants. (D) Fluorescence observation of dFADD’s mutants. (E) Fluorescence observation of dFADD’s mutants after ThT staining. (F) The ratio of puncta-like vs. diffuse distribution of dFADD and its mutants in the absence or presence of PGN.

圖5 dFADD-WT及其突變體對抗菌肽表達的影響Fig. 5 Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of antimicrobial peptides. (A) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Attacin. (B) Effect of dFADD-WT and its mutants on the expression of the antibacterial peptide Diptericin. PGN: DAP-type PGN (10 μg/mL). a–f: differences are assigned by letters, overlapping letters mean no significance.

本研究發(fā)現(xiàn)dFADD也能夠自組裝聚合成類似的功能性淀粉樣蛋白纖維，其能夠與淀粉樣蛋白纖維特異性染料結(jié)合，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的高分子聚合特征，形似纖維。然而，該分子在體外或在模擬體外培養(yǎng)果蠅S2細胞中的聚合能力是較弱的，少數(shù)形成纖維，大部分仍是以無定形的較小聚合物形式存在，或者不發(fā)生聚合以單體形式存在。在PGN刺激下，dFADD形成聚集體的能力有所增強，說明其聚集響應(yīng)免疫誘導(dǎo)。而dFADD-ΔDED突變體不能形成淀粉樣蛋白纖維聚合物并且無法誘導(dǎo)抗菌肽Attacin和Diptericin的表達，進一步說明了淀粉樣蛋白纖維在免疫信號通路中的作用。這些結(jié)果提示dFADD纖維分子可能作為原纖維核心在IMD信號通路中協(xié)同參與了上游IMD的淀粉樣蛋白纖維的形成，改變IMD纖維特征，促進與下游分子Dredd等分子的相互作用，調(diào)控抗菌級聯(lián)信號的傳遞。

有意思的是，dFADD-ΔDD 突變體對抗菌肽Attacin和Diptericin表達的促進能力明顯增強，可能暗示dFADD的DD結(jié)構(gòu)域?qū)FADD淀粉樣蛋白纖維的形成有一定程度的干擾。類似現(xiàn)象也存在于哺乳動物 FADD介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路中，F(xiàn)ADD的DED結(jié)構(gòu)域能夠形成死亡效應(yīng)纖絲，該纖絲的形成是細胞凋亡信號傳遞所必需的。當只表達 DED結(jié)構(gòu)域時，細胞凋亡率要高于同時包含DED結(jié)構(gòu)域和 DD結(jié)構(gòu)域的全長型FADD[24-27]，說明在無DD結(jié)構(gòu)域存在的情況下，DED結(jié)構(gòu)域的功能可能有所增強。統(tǒng)計dFADD-mCherry及其突變體在細胞中呈現(xiàn)聚合形式的比例，發(fā)現(xiàn)dFADD-ΔDD 呈現(xiàn)聚合的比例高于 dFADD-mCherry-WT，這也與二者促進抗菌肽產(chǎn)生的能力相對應(yīng)，當dFADD聚合物增多時，其促進抗菌肽產(chǎn)生的能力進一步增強。

dFADD 通過其 DED 結(jié)構(gòu)域與 Dredd(Caspase8同源物) 相互結(jié)合，促進下游抗菌肽的產(chǎn)生或誘導(dǎo)細胞凋亡。Dredd的 N端也包含兩個DED結(jié)構(gòu)域[28]。筆者研究團隊在研究家蠶 Dredd時，發(fā)現(xiàn)BmDredd能夠聚合形成淀粉樣蛋白纖維，且BmDredd與BmFADD的細胞共定位表明，二者能夠共同聚合形成淀粉樣蛋白纖維聚合物[16]，這提示了果蠅 Dredd也可能形成淀粉樣蛋白纖維聚合物。由此 IMD信號通路中，已鑒定或預(yù)測到PGRP-LC、PGRP-LE、IMD、dFADD與Dredd均能夠形成淀粉樣蛋白纖維聚合物，暗示它們能夠組裝形成類似于在哺乳動物細胞中鑒定到的超分子復(fù)合物，對迅速高效的免疫信號傳遞和抗菌肽的誘導(dǎo)至關(guān)重要，值得深入研究。