楊紹偉 ， 馮 玄 ， 蘭新強 ， 熊瀟然 ， 祁文凱 ， 谷智聰 ， 趙 芳 ， 李劍美，2 ， 趙 鋒，2

(1. 云南省高校民族醫(yī)藥資源研究與東南亞國際合作重點實驗室 普洱學(xué)院生物活性分子與藥物研發(fā)重點實驗室 普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院 ， 云南 普洱 665000 ； 2. 普洱學(xué)院農(nóng)林學(xué)院 ， 云南 普洱 665000)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胡蜂蜂蛹野外采集于云南省普洱市瀾滄縣和墨江縣。實驗動物為昆明系小鼠，體重27～35 g，購自云南昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)中心。所有動物試驗得到普洱學(xué)院實驗動物倫理委員會的批準。

1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH),購自上海金穗生物科技有限公司)；順鉑(Cisplatin, CDDP), 購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、肌酐(Creatinine, Cr)、血清尿素氮(Urea nitrogen, BUN)測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；冰醋酸、石油醚、氯化鈉、考馬斯亮藍R-250，均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試驗試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜂蛹提取物的制備 采集新鮮存活的胡蜂蜂蛹，采用我們開發(fā)的蜂蛹提取物制備方法(專利申請?zhí)? 201910053227.5)制備蜂蛹提取物后，用Bradford法測定樣品蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 蜂蛹提取物對DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基的清除試驗參考張小燕等[22]的方法。

1.2.3 對超氧陰離子自由的基清除作用 將1 mL不同濃度的試驗樣品加入到1.8 mL 50 nmol/L Tris-HCL緩沖液(pH值8.2)中，室溫溫育10 min后，立即將0.1 mL含有10 mmol/L鄰苯三酚的10 mL HCL加入到上述試管中并搖動，于24 ℃下在320 nm檢測5 min吸光度值(ΔAs)，用Tris-HCL緩沖液代替測試樣品作為空白對照(ΔAb)。超氧自由基清除能力(%)=(ΔAb-ΔAs)/ΔAb×100%。

1.2.4 動物模型制備 動物建模參考高晶晶等[23]的方法，并略有修改。選取18只健康雄性小鼠(動物倫理許可證號：ACUP.531068520171226)，隨機分為對照組、順鉑組和蜂蛹組，每組各6只。對照組和順鉑組分別給予0.3 mL 0.9%生理鹽水，每天1次，共15 d。蜂蛹組按200 mg/(kg·bw)的劑量灌胃蜂蛹提取物，每天1次，連續(xù)15 d。于灌胃的第11天開始，順鉑組和蜂蛹組分別按2 mg/(kg·bw)注射順鉑溶液，每天1次，連續(xù)5 d，對照組注射0.9%生理鹽水[23]。期間小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，監(jiān)控攝食量，記錄每日體重變化。

1.2.5 生化檢測及組織標本采集 末次用藥24 h 后，斷尾取血，并取腎組織及尿液，4 ℃低溫保存。分別測定血清、腎組織及尿液中的SOD，GSH-Px，MD，Cr， BUN水平。

1.2.6 腎組織標本H.E.染色 取相同部位腎臟，用2.5%戊二醛溶液固定。脫水、透明后石蠟包埋切片，脫蠟復(fù)水；蘇木精-伊紅(H.E.)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的組織形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 蜂蛹提取物的抗氧化效果

2.1.1 蜂蛹提取物對DPPH自由基的清除作用 由圖1可知，在0～200 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，蜂蛹提取物對DPPH自由基的清除率呈劑量依賴性(圖1A)。當蜂蛹提取物濃度達到200 mg/mL時，清除率達到57%左右。

2.1.2 蜂蛹提取物對氧自由基的清除作用 由圖1可知，蜂蛹蛋白提取物對氧自由基清除效果明顯，0～5 mg/mL時蜂蛹蛋白對氧自由基的清除作用隨蜂蛹蛋白劑量增加而增加，在蜂蛹蛋白劑量5 mg/mL時達到90%左右(圖1B)?？寡趸瘎┘熬哂凶杂苫宄钚缘奈镔|(zhì)對順鉑所致的氧化應(yīng)激有保護作用[12-13]，蜂蛹提取物有良好的自由基清除作用，為進一步研究對順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷的保護作用提供依據(jù)。

圖1 蜂蛹提取物的抗氧化效果

2.2 蜂蛹提取物對氧化應(yīng)激酶系的影響

2.2.1 血清中SOD、GSH-Px、MDA、Cr和BUN的變化 由圖2可知，注射過順鉑后，順鉑組與對照組相比，小鼠血清SOD和GSH-Px的活力降低，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；蜂蛹組與對照組相比，小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力無明顯差異(P>0.05)；蜂蛹組與順鉑組相比，小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力明顯升高，約2倍(P<0.05，圖2A-B)。說明蜂蛹提取物能夠提高順鉑損傷腎臟后的小鼠的血清SOD、GSH-Px活力。

腎小球濾過率(Glomerular filtration rate，GFR)是評價腎臟濾過功能的直接相關(guān)指標，而GFR不能直接檢測，只能通過某種特定的內(nèi)源性或外源性濾過標志物如Cr、BUN等而得到。由圖2可知，順鉑組與對照組相比，順鉑組小鼠血清中MDA含量升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；蜂蛹組與對照組相比，小鼠血清中MDA含量無明顯變化(P>0.05，圖2C)。順鉑組與對照組相比，小鼠血清Cr的含量和BUN含量升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；蜂蛹組與對照組相比，小鼠血清中Cr和BUN的含量無明顯差異(P>0.05，圖2E)。蜂蛹組與順鉑組相比，小鼠血清中Cr的含量極明顯降低(P<0.01)，BUN含量明顯下降(P<0.05，圖2D-E)。說明蜂蛹提取物能夠降低腎損傷小鼠血清MDA，使血清Cr、BUN水平恢復(fù)。

2.2.2 蜂蛹提取物對腎組織SOD和GSH-Px活性的影響 注射順鉑后，順鉑組與對照組相比，小鼠腎組織SOD無顯著差異(P>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，腎組織SOD活性高于模型組(P<0.05)，極顯著高于對照組(P<0.01，圖2F)。模型組腎組織GSH-Px活性較對照物顯著差異(P>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，腎組織GSH-Px活力提高，極顯著高于對照組與模型組(P<0.01，圖2G)。這些結(jié)果提示，蜂蛹提取物能夠提高或恢復(fù)小鼠腎臟的機能。

圖2 血清SOD和GSH-Px活性，MDA、Cr和BUN含量的變化結(jié)果

2.2.3 蜂蛹提取物對小鼠尿液Cr和Bun的影響 由圖3可知，與對照組相比，注射順鉑后，小鼠尿液Cr、Bun上升，但無顯著差異(P>0.05)；灌胃蜂蛹后，與模型組相比尿液Cr、Bun無明顯下降，但是個體間差異幅度減小，較模型組更穩(wěn)定(圖3A-B)。以上結(jié)果提示，蜂蛹提取物能在一定程度上保護損傷腎臟。氧化應(yīng)激在順鉑腎毒性中有重要作用[24]，蜂蛹提取物提高血清中氧化應(yīng)激相關(guān)酶系的活性，進一步表明蜂蛹提取物對順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷的保護作用。

圖3 蜂蛹提取物對小鼠尿液肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的影響

2.3 小鼠體重變化及蜂蛹提取物對腎組織形態(tài)學(xué)影響 由圖4可知，試驗過程中監(jiān)測了小鼠體重變化，試驗前10天各組體重皆隨時間增長而增長，蜂蛹組增長量遠高于正常組，提示蜂蛹具有極高營養(yǎng)價值；后5天模型組與蜂蛹組均下降，這可能是由于順鉑損傷腎臟引起的體質(zhì)虛弱(圖4A)。順鉑導(dǎo)致小鼠體重減輕，可能是由于其胃腸道毒性導(dǎo)致小鼠攝食量的減少[12]，雖然本試驗中灌胃蜂蛹提取物后未能明顯改善順鉑引起的小鼠體重下降，但是蜂蛹提取物能在術(shù)前改善動物體質(zhì)，減緩順鉑引起的毒性。與對照組正常小鼠腎臟組織(圖4B)相比，順鉑組小鼠腎臟組織細胞松散，出現(xiàn)透明細胞、炎性細胞浸潤現(xiàn)象(圖4C)；蜂蛹組小鼠腎臟組織相對于順鉑組，透明細胞和炎性細胞浸潤現(xiàn)象有所改善，其損傷程度明顯減輕(圖4D)。提示蜂蛹提取物對順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷具有保護作用。

3 討論

中國蜂蛹資源豐富，蜂蛹主要用在保健食品、養(yǎng)生保健酒、保健沖劑等方面[25-26]。早在公元前1 200年前的古籍《爾雅》，以及公元前3世紀的《禮記》中就已經(jīng)有食用蜂子的記載。在長沙馬王堆出土的古醫(yī)方帛書《五十二病例》就有用蜂胎和蜂子治病的配方[27]。蜂蛹干物質(zhì)主要組成和所占比例是：蛋白質(zhì)(46.21%)、脂肪(26.09%)、碳水化合物(20.34%)、總糖(0.73%)、幾丁質(zhì)(4.37%)等。蜂蛹中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，富含黃酮類化合物、維生素類、酶類等多種活性成分，具有良好的抗氧化作用[28-30]。

本試驗測定了蜂蛹提取物的體外抗氧化能力及小鼠血清中幾種抗氧化物酶的活性和脂質(zhì)過氧化水平。在一定濃度范圍內(nèi)，蜂蛹提取物清除超氧自由基、DPPH自由基的能力呈劑量依賴性，對超氧陰離子清除效果良好。目前，順鉑毒副作用的防治主要有調(diào)整給藥方式、水化療法、使用拮抗劑等方法[5]。本試驗中使用天然產(chǎn)物保護順鉑致小鼠腎損傷，順鉑的誘導(dǎo)致使小鼠SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量升高，但灌胃蜂蛹提取物能增加SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，對腎臟有一定的保護作用。同時，本試驗結(jié)果表明，順鉑誘導(dǎo)致小鼠Cr和BUN含量升高，灌胃蜂蛹提取物能顯著降低Cr和BUN的含量，對腎小球有一定的保護作用。通過觀察H.E.染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射順鉑后，小鼠肝臟出現(xiàn)細胞排列疏松，腎臟組織出現(xiàn)透明細胞、炎性細胞浸潤的現(xiàn)象，但是蜂蛹提取物灌胃后，肝、腎細胞排列疏松，透明細胞、炎性細胞浸潤現(xiàn)象減少，其損傷程度減輕，對小鼠的肝、腎組織的損傷有顯著的改善。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)，對照組和順鉑組灌胃和靜脈注射0.9%生理鹽水，小鼠體重都略有減輕，尤其注射過順鉑的順鉑組和蜂蛹組；但是，試驗前10天蜂蛹組灌胃蜂蛹提取物后，小鼠體重明顯增加，說明灌胃蜂蛹提取物可以明顯改善小鼠體質(zhì)。綜上所述，蜂蛹提取物對順鉑誘導(dǎo)的腎損傷具有一定的保護作用，為藥食用資源的開發(fā)和產(chǎn)品研制提供更多依據(jù)。