汪嘉炎 李文英

(1.寧波大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

0 引言

四環(huán)素類(lèi)抗生素(TCs)是廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、衣原體、支原體、螺旋體和放線菌都有較強(qiáng)的作用，因此被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)[1,2].過(guò)度使用TCs可能會(huì)導(dǎo)致食品和環(huán)境中存在抗生素殘留，長(zhǎng)期攝入殘留四環(huán)素的食物會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，包括出現(xiàn)抗生素耐藥性，過(guò)敏反應(yīng)，肝臟和牙齒損害等[2,3].歐盟和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局公布的食品中允許的四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量最大值為分別為225 nM和676 nM，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)為100 μg·mL-1與歐盟標(biāo)準(zhǔn)一致.因此，對(duì)環(huán)境及畜牧業(yè)產(chǎn)品中的四環(huán)素進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要的意義.

目前，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的用于TCs檢測(cè)的方法包括高效液相色譜法[4,5]、質(zhì)譜分析法[6,7]、免疫法[8,9]、電泳法[10,11]和微生物法[12,13]等.然而，上述方法仍有一些缺點(diǎn)，例如質(zhì)譜分析儀價(jià)格昂貴，高效液相色譜法比較費(fèi)時(shí)，而免疫法和微生物法樣品制備較為復(fù)雜[14,15].熒光分析法相對(duì)操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間快、靈敏度高，且易于設(shè)計(jì)成試紙條，因此，很多研究者致力于發(fā)展可應(yīng)用于四環(huán)素檢測(cè)的熒光分析方法[16,17].

四環(huán)素能夠淬滅發(fā)光材料的熒光，因此許多檢測(cè)四環(huán)素的熒光分析方法都是基于合成新穎的熒光納米材料，目前已經(jīng)報(bào)道的可以用于四環(huán)素檢測(cè)的熒光材料有量子點(diǎn)[18,19]、碳點(diǎn)[20,21]、熒光共軛聚合物[22,23]以及熒光金屬有機(jī)骨架[24-26]等.金屬有機(jī)骨架材料(MOF)是一類(lèi)由金屬離子與有機(jī)配體組成的化合物，由于它具有比表面積大、化學(xué)組成可調(diào)、孔結(jié)構(gòu)可控、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和制備過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，所以受到了研究者的廣泛關(guān)注[27-34].基于金屬有機(jī)骨架的熒光納米材料，其光譜和孔隙易于通過(guò)改變配體而調(diào)節(jié)，且容易進(jìn)行共價(jià)修飾，因此在傳感檢測(cè)方面被廣泛應(yīng)用，已經(jīng)被報(bào)道用于金屬離子、硝基甲烷、氣體、pH值以及溫度等的檢測(cè)[35-39].但是，傳統(tǒng)的MOF通常水穩(wěn)定性和水溶性都較差，不利于水體中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè).本工作以銅離子為配位金屬，5-氨基間苯二甲酸為配體，合成了一種發(fā)藍(lán)色熒光的Cu-MOF的片層結(jié)構(gòu)，并利用四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)Cu-MOF熒光的淬滅作用，構(gòu)建了一種四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

硝酸銅、5-氨基間苯二甲酸、各種金屬鹽溶液、頭孢購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司.土霉素(OTC)，金霉素、強(qiáng)力霉素(DOXC)，青霉素，氨芐青霉素，以及配置緩沖液所用試劑購(gòu)自生工生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海).所有化學(xué)藥品均為分析試劑級(jí)，市售，購(gòu)買(mǎi)后直接使用未經(jīng)任何處理.

1.2 表征與測(cè)試儀器

合成的納米材料的形貌和組成由美國(guó)掃描電子顯微鏡、美國(guó)Thermo Fisher ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀進(jìn)行分析.紫外可見(jiàn)吸收光譜由中國(guó)上海光譜儀器有限公司紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量獲得，熒光光譜測(cè)量?jī)x器為日本島津熒光分光光度計(jì)(RF-5301)，熒光壽命測(cè)量?jī)x器為法國(guó)HoribaJobin Yvon熒光光譜儀FL3-TCSPC.

1.3 發(fā)光Cu-MOF的合成

將0.2 g PVP充分溶解于4 mL乙醇和4 mL DMF，得到溶液A；將0.024 g Cu(NO3)2·3H2O和0.0054 g 5-氨基間苯二甲酸充分溶解于4 mL DMF，得到溶液B；將溶液A和溶液B混勻并超聲作用20 min；然后將上述混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中升溫至100 ℃并反應(yīng)8 h；反應(yīng)結(jié)束后離心醇洗3次,干燥后得到藍(lán)色Cu-MOF粉末；最后稱取適量Cu-MOF粉末溶于去離子水中得到0.2 mg/mL的溶液備用.

1.4 發(fā)光Cu-MOF的光譜性質(zhì)

將200 μL 10 mM MOPS緩沖液(pH 7.0)，60 μL 鹽酸四環(huán)素溶液(儲(chǔ)存液濃度：1 mM)，不同體積Cu-MOF溶液(儲(chǔ)存液濃度：0.2 mg mL-1)和去離子水加入到樣品管中，使其總體積為2 mL.在該測(cè)試體系中，Cu-MOF溶液濃度分別為5、10、20、30、40 μg mL-1.所得測(cè)試體系在室溫下孵育5 min，然后進(jìn)行光譜測(cè)試.

1.5 四環(huán)素分析檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)曲線：將200 μL 10 mM MOPS緩沖液(pH 7.0)，100 μL Cu-MOF溶液(儲(chǔ)存液濃度：0.2 mg mL-1)，不同體積的鹽酸四環(huán)素溶液(儲(chǔ)存液濃度：1 mM)和去離子水加入到樣品管中，使其總體積為2 mL.在該測(cè)試體系中，鹽酸四環(huán)素濃度分別為0、1、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100和110 μM.所得測(cè)試體系在室溫下孵育5 min，然后進(jìn)行光譜測(cè)試.

選擇性考察：對(duì)于干擾實(shí)驗(yàn)，將200 μL 1 mM干擾分析物添加到測(cè)試體系中，干擾分析物的最終濃度均為100 μM，其他條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試保持一致.

實(shí)際樣品檢測(cè)：環(huán)境水樣品測(cè)試取自寧波市甬江水(寧波大學(xué)附近支流)作為測(cè)試樣品，甬江水經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單離心處理即可進(jìn)行測(cè)試.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)光Cu-MOF的表征

合成的Cu-MOF的形貌用SEM進(jìn)行了表征，如圖1(a)所示.從圖中可以看出，合成的Cu-MOF展示出了二維的片狀結(jié)構(gòu)，片狀結(jié)構(gòu)交錯(cuò)形成花狀結(jié)構(gòu).這種平面結(jié)構(gòu)有利于四環(huán)素與Cu-MOF之間的相互作用.X射線光電子能譜用于分析Cu-MOF的組成，如圖1(b)所示，合成的Cu-MOF主要由Cu、C、N和O四種元素組成.其中C、O以及N元素來(lái)自于配體和PVP，而金屬來(lái)自于參與配位的銅鹽.

圖1 (a)發(fā)光Cu-MOF的SEM圖；(b)Cu-MOF的XPS圖

發(fā)光Cu-MOF的光學(xué)性質(zhì)通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜分別進(jìn)行表征.如圖2(a)所示，所合成的Cu-MOF材料在302 nm處具有一個(gè)明顯的吸收峰；此外，根據(jù)熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，Cu-MOF的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為318 nm和402 nm.如圖2(b)所示，通過(guò)考察不同激發(fā)波長(zhǎng)下，Cu-MOF在402 nm處所發(fā)射的熒光強(qiáng)度也可以發(fā)現(xiàn)，Cu-MOF的熒光強(qiáng)度是依賴于激發(fā)波長(zhǎng)的，這表明Cu-MOF在測(cè)試體系中是均勻分布的.

圖2 (a) Cu-MOF的紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜；(b) 不同激發(fā)波長(zhǎng)下Cu-MOF的熒光強(qiáng)度

為探究pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，依次測(cè)定Cu-MOF在pH=4-9的熒光強(qiáng)度，如圖3(a)所示，該材料在pH=4-9的環(huán)境中，均具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，可以滿足分析測(cè)試的要求，具有較好的適用范圍；此外，為探究Cu-MOF的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，在濃度為0.01 mg mL-1，pH=7.0的情況下測(cè)定35 min，如圖3(b)所示，該材料在35 min內(nèi)的熒光強(qiáng)度基本保持不變，具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足本實(shí)驗(yàn)的要求.

圖3 (a)pH對(duì)Cu-MOF的影響；(b)Cu-MOF的熒光隨時(shí)間的變化

2.2 不同濃度Cu-MOF檢測(cè)性能

如圖4所示，在測(cè)試體系中沒(méi)有四環(huán)素時(shí)，隨著Cu-MOF濃度的升高，其熒光強(qiáng)度也隨之增長(zhǎng)，當(dāng)加入固定量四環(huán)素后，不同濃度的Cu-MOF熒光體系均出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降，且下降幅度基本一致，表明定量四環(huán)素對(duì)于Cu-MOF熒光的淬滅是穩(wěn)定的，不隨Cu-MOF濃度的變化而明顯改變，說(shuō)明不同濃度Cu-MOF的檢測(cè)性能較為穩(wěn)定，有利于實(shí)際測(cè)試應(yīng)用.

圖4 不同濃度Cu-MOF檢測(cè)性能(測(cè)試體系四環(huán)素濃度為30 μM)

2.3 四環(huán)素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化的檢測(cè)條件下，對(duì)不同濃度的四環(huán)素進(jìn)行檢測(cè).如圖5(a)所示，當(dāng)測(cè)試體系中沒(méi)有四環(huán)素時(shí)，Cu-MOF發(fā)射藍(lán)色熒光，發(fā)射光譜峰值在400 nm.隨著四環(huán)素的加入，Cu-MOF的熒光被逐漸淬滅，且出現(xiàn)紅移，在0-60 μM的范圍內(nèi)，在400 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度持續(xù)降低.而當(dāng)四環(huán)素濃度大于60 μM后，Cu-MOF熒光強(qiáng)度降低變緩.Cu-MOF在400 nm處熒光強(qiáng)度與四環(huán)素濃度在0-60 μM范圍內(nèi)線性相關(guān)(圖5(b))，線性回歸方程為F=253.59-3.108C，R2=0.997，其中C是四環(huán)素的濃度.根據(jù)空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍計(jì)算出的TCs檢測(cè)的檢測(cè)限為33.33 nM，這個(gè)值遠(yuǎn)低于中國(guó)、美國(guó)和歐盟標(biāo)準(zhǔn).

圖5 (a) Cu-MOF熒光發(fā)射光譜隨四環(huán)素濃度增加的變化；(b) 四環(huán)素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 Cu-MOF熒光淬滅機(jī)理

熒光淬滅的機(jī)理具有許多可能的途徑，例如靜態(tài)淬滅、動(dòng)態(tài)淬滅、共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)(ACQ)、光致電子轉(zhuǎn)移(PET)和內(nèi)濾波效應(yīng)(IFE)等.熒光的淬滅?？梢杂蒘tern-Volmer方程解釋描述

F0/F=1 +KSVcq=1 +Kqτ0cq，

(1)

其中F0和F分別為熒光測(cè)試體系中不存在四環(huán)素與存在四環(huán)素時(shí)的熒光強(qiáng)度，cq為測(cè)試體系中四環(huán)素的濃度，KSV是動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)，Kq是淬滅常數(shù)，而τ0是Cu-MOF的熒光壽命.如圖6(a)所示，線性檢測(cè)范圍的F0/F與cq呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算得KSV為0.03818 μM-1.圖6(b)得到τ0為4.278 ns，計(jì)算得Kq為8.925×1012M-1S-1，因此是靜態(tài)淬滅.圖6(b)顯示，Cu-MOF溶液加入四環(huán)素后，熒光壽命不變，也說(shuō)明Cu-MOF的熒光淬滅的本質(zhì)為靜態(tài)淬滅.

圖6 (a)F0/F與四環(huán)素濃度的線性關(guān)系；(b)Cu-MOF熒光體系在有無(wú)四環(huán)素時(shí)熒光壽命

利用紫外可見(jiàn)吸收光譜，我們對(duì)Cu-MOF的淬滅機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的探究.如圖7(a)所示，四環(huán)素吸收光譜與Cu-MOF吸收和發(fā)射都有重疊，對(duì)應(yīng)熒光淬滅可能的機(jī)理為IFE和FRET，而加入四環(huán)素后Cu-MOF熒光壽命不變，所以我們認(rèn)為可以排除FRET淬滅機(jī)理，即IFE在Cu-MOF的淬滅中占主導(dǎo)作用.為了探究IFE在Cu-MOF的熒光淬滅過(guò)程中的作用，我們使用以下公式(2)對(duì)熒光進(jìn)行校正

Fcorr/Fobs=10(A(ex)+A(em))/2，

(2)

其中Fobs是測(cè)量得到的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)corr是從Fobs去除IFE影響后的熒光強(qiáng)度，A(ex)和A(em)分別為Cu-MOF溶液測(cè)試體系在激發(fā)波長(zhǎng)(318 nm)和發(fā)射波長(zhǎng)(402 nm)處的吸光度.對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正后，我們分別計(jì)算了校正前后的熒光抑制效率，如圖7(b)所示，在Cu-MOF熒光的淬滅中，IFE起到主要作用，因此Cu-MOF熒光淬滅機(jī)理的主要為IFE.

圖7 (a)四環(huán)素吸收光譜與發(fā)光Cu-MOF激發(fā)和發(fā)射光譜的重疊；(b)添加不同濃度TC后Cu-MOF的熒光抑制率，Eobs=1- Fobs/F0,obs，Ecorr=1-Fcorr/F0,corr，F(xiàn)和F0分別是存在和不存在TC時(shí)的熒光強(qiáng)度

2.5 選擇性考察

我們考察各種金屬離子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Hg2+)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素)以及其他類(lèi)抗生素(青霉素G、鏈霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉)對(duì)發(fā)光Cu-MOF熒光傳感體系的影響，Cu-MOF在400 nm處的熒光變化如圖8所示.加入四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素等四環(huán)素類(lèi)抗生素后，Cu-MOF的熒光淬滅程度都較高，而其他干擾物的加入對(duì)Cu-MOF的熒光較小.值得一提的是，在眾多的依賴于對(duì)發(fā)光納米材料熒光的淬滅而構(gòu)建的分析方法中，Cu2+、Fe3+、Pb2+、Hg2+是非常常見(jiàn)的淬滅劑，而在本方法中，即便加入高濃度也未見(jiàn)明顯淬滅.由此可見(jiàn)，我們的方法有很好的選擇性.

圖8 選擇性考察(所有干擾物質(zhì)的濃度均為100 μM).A為未添加干擾物質(zhì)的正常測(cè)試體系，B～Q分別是：鹽酸四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素、金霉素、NaCl2、MgSO4、KI、CaCl2、Cu(NO3)2、FeCl3、Pb(NO3)2、HgCl2、鏈霉素、青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟鈉.

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

為探索發(fā)光Cu-MOF體系在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，我們將對(duì)四環(huán)素的檢測(cè)擴(kuò)展到河水樣品中.取寧波甬江水樣品，簡(jiǎn)單離心除去不溶物，并將上清液用于四環(huán)素分析.至實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未加標(biāo)準(zhǔn)樣品的甬江水樣品不會(huì)影響Cu-MOF熒光發(fā)射強(qiáng)度.隨后我們進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，如表1所示，三組獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)回收率分別為96.17%、105.02%和97.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為7.5%、5.4%和2.1%，均在合理的范圍內(nèi)，這證明我們的方法可以應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境水樣品的檢測(cè).

3 結(jié)論

本工作利用四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)發(fā)光Cu-MOF熒光的淬滅作用，構(gòu)建了一種四環(huán)素類(lèi)抗生素含量的檢測(cè)方法，并成功應(yīng)用于環(huán)境水樣品中四環(huán)素類(lèi)抗生素的分析.本方法具有3個(gè)特點(diǎn)：(1) 由于引入氨基和PVP，本工作合成的Cu-MOF在水溶液中的溶解性和穩(wěn)定性都更好；(2) 本方法的靈敏度高，其檢測(cè)限遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)外規(guī)定的最大值，選擇性及穩(wěn)定性均較好，對(duì)常見(jiàn)的能夠淬滅熒光的金屬離子與四環(huán)素有較好的區(qū)分;(3) 此工作實(shí)現(xiàn)了發(fā)光Cu-MOF對(duì)環(huán)境水樣品中四環(huán)素的檢測(cè)，有望應(yīng)用于實(shí)際分析檢測(cè)中.