姜巖世，張永祥，劉利平，劉力，王鵬杰，王然

（1.西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司，拉薩 610000；2.三河福成生物科技有限公司，廊坊 065201；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京 100083）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis）是一種非特異性炎癥性腸病，臨床上主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便[1]，具有難治性且極容易復(fù)發(fā)，并存在癌變風(fēng)險，故被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[2]。UC發(fā)病機(jī)制尚不明確，與腸道通透性增加、炎癥反應(yīng)、免疫和腸道菌群紊亂等多種因素相關(guān)[3]。

益生菌能夠降低腸道通透性、調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫系統(tǒng)，因此，對UC具有潛在的治療效果[4]。研究表明，雙歧桿菌三聯(lián)活菌可以通過影響緊密連接蛋白的表達(dá)和分布來增強(qiáng)腸道屏障的完整性，防止病原菌和化學(xué)物質(zhì)對其破壞[5]。嬰兒雙歧桿菌能夠增加腸道上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，從而增強(qiáng)上皮細(xì)胞的屏障功能，并改善IL-10敲除小鼠的結(jié)腸炎癥狀[6]。益生菌的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、過氧化氫、細(xì)菌素、抗菌活性肽等，可以有效減少腸內(nèi)有毒物質(zhì)氨和胺的產(chǎn)生，同時抑制外毒素的生成，減少腸道致病菌對腸道的傷害，維持腸道菌群的正常平衡，達(dá)到預(yù)防和減輕UC發(fā)病的效果[7]。

本研究以分離自西藏牦牛乳的動物雙歧桿菌NMC為研究對象，體外評價其耐酸耐膽鹽能力，并利用DSS誘導(dǎo)Balb/C雄性小鼠構(gòu)建UC模型，探討其對UC的預(yù)防能力，為相關(guān)益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

動物雙歧桿菌NMC，中國微生物菌種保藏中心保藏，CGMCC No.12944。

1.1.2 材料

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Biomedicals公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）試劑盒，美國Ebioscience公司；anti-ZO-1、anti-Occludin、anti-E-cadherin，美國Abcam公司；兔抗鼠酶標(biāo)二抗，中國Beyotime公司；8周齡SPF級Balb/C野生型雄性小鼠，購買于北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；維持飼料購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 儀器

CKX-41型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)，美國MilliPore公司；PB3002-N型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；石蠟切片機(jī)，德國Leica公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐酸、耐膽鹽測定[8]

將菌株以1%接種量接種傳代并進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，每代培養(yǎng)12h，在第二代培養(yǎng)12h后，將菌液在4 500r/min條件下離心10min，把菌體分別重懸于pH3（鹽酸調(diào)節(jié)pH）的MRSC培養(yǎng)基和膽鹽濃度為0.3%的MRSC培養(yǎng)基中，在0、1、2、3、4h時測其活菌數(shù)，并計算存活率（存活率=最終活菌數(shù)/初始活菌數(shù)）。

1.2.2 急性潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的建立[9]

8周齡SPF級Balb/C野生型雄性小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為對照組、模型組、菌低劑量組（NMCL組）、菌中劑量組（NMCM組）、菌高劑量組（NMCH組）。對照組在整個試驗(yàn)期間灌胃生理鹽水；試驗(yàn)前7d，模型組灌胃生理鹽水，各菌劑量組分別灌胃0.2mL不同濃度的菌液，小鼠每天的灌胃劑量分別為5×108CFU/kg、5×109CFU/kg和5×1010CFU/kg；從第8天開始，除對照組外，各組在灌胃同時自由飲用2.5% DSS溶液，為期7d，造成試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，造模期間每日觀察小鼠的一般狀況、體質(zhì)量、大便性狀和隱血情況。

1.2.3 小鼠結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分

造模過程中觀察并記錄小鼠體重變化、糞便性狀及大便隱血/肉眼血便情況，并按表1進(jìn)行DAI綜合評分[10]。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 結(jié)腸長度測量

試驗(yàn)14d結(jié)束后脫頸處死小鼠，取出肛門至盲腸末端的整個腸斷，觀察結(jié)腸的外觀形態(tài)，并測量長度。

1.2.5 結(jié)腸組織病理分析

取結(jié)腸遠(yuǎn)端炎癥反應(yīng)明顯處約1cm的結(jié)腸組織，于10%的甲醛中固定72h后，用乙醇作脫水劑除去組織中的水分，于二甲苯中透明后用石蠟包埋，固定于切片機(jī)上切成薄片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色。以盲法觀察腸黏膜損傷情況，并進(jìn)行組織學(xué)損傷評分。

1.2.6 結(jié)腸組織炎癥因子檢測

利用ELISA法測定小鼠結(jié)腸組織中的促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，試驗(yàn)操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 21.0單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐酸、耐膽鹽評價

雙歧桿菌等益生菌必須具有強(qiáng)的耐高胃酸和耐高膽鹽的能力，才能活著到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用。研究表明，胃液的pH值為3左右，十二指腸的膽鹽濃度為0.3g/kg左右[11,12]，本試驗(yàn)以pH值為3（鹽酸調(diào)節(jié)pH）和膽鹽濃度為0.3%模擬人體腸道環(huán)境，研究動物雙歧桿菌NMC對胃酸和膽鹽的耐受能力。如圖1所示，在pH 3.0條件下培養(yǎng)1～4h，動物雙歧桿菌NMC活菌數(shù)發(fā)生下降，培養(yǎng)4h與0h相比活菌數(shù)下降一個數(shù)量級，下降幅度較小，證明該菌株對胃酸具有良好的耐受性。在0.3%的膽鹽濃度下培養(yǎng)1～4h，在前3h內(nèi)活菌數(shù)變化不大，第4h，活菌數(shù)發(fā)生顯著下降，與0h相比活菌數(shù)下降2數(shù)量級，下降幅度較小，證明該菌株對膽鹽具有良好的耐受性。

圖1 動物雙歧桿菌NMC對酸和膽鹽的耐受性

2.2 結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后對小鼠進(jìn)行DAI綜合評分，結(jié)果如表2所示，模型組小鼠DAI評分最高，為8.81±2.25，顯著高于對照組（P＜0.05），表明小鼠造模成功；經(jīng)動物雙歧桿菌NMC處理后，各組小鼠的DAI評分有不同程度降低，低、中、高劑量組分別為6.56±1.35、4.37±0.95、3.89±0.99，各劑量組DAI分?jǐn)?shù)均顯著低于模型組（P＜0.05），表明動物雙歧桿菌NMC對UC具有一定的預(yù)防作用。

2.3 小鼠結(jié)腸情況及長度的變化

圖2 各組小鼠結(jié)腸長度

本試驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，對照組小鼠結(jié)腸組織完好、腸腔內(nèi)糞便成形；模型組結(jié)腸腸腔內(nèi)可見不成形暗紅色血便；動物雙歧桿菌NMC各組小鼠腸腔內(nèi)出血減少，糞便基本成形。對照組小鼠結(jié)腸長度最長，為11.2±0.8cm，模型組最短，為7.8±0.6cm，NMC低、中、高劑量組分別為8.7±0.5cm、9.5±0.7cm和10.9±0.5cm，與模型組相比，均有顯著增加，其中高劑量組結(jié)腸長度與對照組相比沒有顯著差異（圖2），表明動物雙歧桿菌對潰瘍性結(jié)腸炎導(dǎo)致的小鼠結(jié)腸長度的縮短有抑制作用，并呈劑量依賴性。

2.4 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)炎癥評分

UC的病變多累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸，結(jié)腸黏膜出現(xiàn)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤和多發(fā)性潰瘍[13]。小鼠結(jié)腸組織病理切片HE染色如圖3所示，對照組小鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞正常，隱窩正常，腺體排列整齊，未見黏膜潰爛，無炎性細(xì)胞的浸潤，其組織病理學(xué)炎癥評分為0；模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織損傷明顯，黏膜嚴(yán)重缺損、出血、腺體紊亂、隱窩破壞，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，深度達(dá)整個黏膜層，組織病理學(xué)炎癥評分為9.8±1.5，表明造模成功；動物雙歧桿菌NMC處理后，結(jié)腸黏膜損傷減輕，腺體、隱窩破壞減輕，炎性細(xì)胞浸潤減輕，低、中、高劑量組評分分別為6.5±1.1、4.8±0.9和4.2±0.5，顯著低于模型組（表2），表明該菌能夠預(yù)防小鼠結(jié)腸組織損傷，并具有劑量依賴性。

圖3 小鼠結(jié)腸組織HE切片

表2 各組小鼠DAI評分及結(jié)腸組織病理評分

2.5 小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的變化

受損的腸黏膜上浸潤的大量炎性細(xì)胞可分泌炎癥因子，進(jìn)而對腸黏膜造成損傷，放大炎癥反應(yīng)[14]。本研究利用ELISA法測定了小鼠血清中的炎癥因子水平，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，模型組中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），表明UC可導(dǎo)致小鼠血清中促炎因子的表達(dá)量升高；與模型組相比，經(jīng)動物雙歧桿菌NMC干預(yù)后，低、中、高劑量組促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表達(dá)量顯著下降，并呈劑量依賴性，表明動物雙歧桿菌NMC能夠抑制促炎因子的表達(dá)，降低腸上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而預(yù)防UC的發(fā)生和發(fā)展。

圖4 各組小鼠血清中促炎因子的表達(dá)

3 結(jié)論

本研究探討了動物雙歧桿菌NMC的耐酸耐膽鹽能力及預(yù)防UC的作用。結(jié)果表明，動物雙歧桿菌NMC在pH3.0，0.3%膽鹽濃度環(huán)境下具有良好的耐受性。在利用DSS誘導(dǎo)小鼠建立UC模型時，動物雙歧桿菌NMC可顯著降低UC小鼠DAI評分，緩解結(jié)腸長度縮短，緩解結(jié)腸黏膜損傷和炎癥細(xì)胞浸潤，降低結(jié)腸組織病理評分，降低促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表達(dá)，從而預(yù)防UC的發(fā)生和發(fā)展。