李寶晶 王亭

【摘 要】 目的：研究雙姜胃痛丸對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用，初步考察其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。方法：采用熱板法和甲醛足底注射致痛法，以阿司匹林（0.2 g/kg）為陽(yáng)性對(duì)照藥，研究雙姜胃痛丸高、中、低劑量組（3.00 g生藥/kg、1.50 g生藥/kg、0.75 g生藥/kg）的鎮(zhèn)痛作用。試劑盒法檢測(cè)小鼠甲醛注射側(cè)后足組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α和前列腺素（PG）E2的含量及小鼠大腦組織中5-羥色胺（HT）和谷氨酸（Glu）的含量，PCR法檢測(cè)小鼠甲醛注射后足組織中單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1的表達(dá)。結(jié)果：雙姜胃痛丸中劑量能提高熱刺激小鼠的痛閾值，高劑量能縮短甲醛致痛小鼠的Ⅰ相舔、咬足時(shí)間，低、中、高劑量組均能顯著縮短Ⅱ相舔、咬足時(shí)間，并明顯降低小鼠甲醛注射后足組織中PGE2含量、TNF-α含量和MCP-1 mRNA表達(dá)水平，但對(duì)小鼠大腦組織中5-HT和Glu含量無(wú)明顯影響。結(jié)論：雙姜胃痛丸具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機(jī)制與減輕局部炎癥因子和致痛介質(zhì)釋放相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 雙姜胃痛丸;甲醛致痛;前列腺素E2;腫瘤壞死因子-α;單核細(xì)胞趨化蛋白-1

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）12-0013-05

Abstract：Objective To investigate analgesic effect of Shuangjiang Weitong Pill（SJWT）in mice. Methods After oral administration of SJWT（0.75，1.50，3.00 g/kg）for 7 days，the hot plate test and formalin-induced pain model were used to assess the analgesic effect of SJWT. After formalin test，prostaglandin（PG）E2 and tumor necrosis factor（TNF）-α concentrations of the injected paw tissue，5-hydroxytryptamine（HT）and glutamic acid concentrations of brain tissue were detected by ELISA，and of the injected paw tissue monocyte chemoattractant protein（MCP）-1 mRNA expression was determined by Q-PCR. Results SJWT at 1.50 g/kg prolonged the latency time induced by hot stimuli，SJWT at 3.00 g/kg reduced total time of licking，biting the injected paw in phase Ⅰ. SJWT at each dosage reduced total time of licking，biting the injected paw in phase Ⅱ，and reduced TNF-α and PGE2 concentrations and the expression of MCP-1 of the injected paw tissue. Conclusions SJWT could exert analgesic effect on mice，and the potential mechanism might be related to decrease the production and release of proinflammatory factors and nociception factors.

Keywords：Shuangjiang Weitong Pill;Formalin–Induced Mice Pain Model;Prostaglandin（PG）E2; Tumor Necrosis Factor（TNF）-α; Monocyte Chemoattractant Protein（MCP）-1

雙姜胃痛丸為傣藥成藥，其組方被列為傣醫(yī)的經(jīng)典藥方。全方由毫命（姜黃Curcuma longa Linn.）、補(bǔ)累（紫色姜Zingiber purpureum Rosc.）、波波罕（地不容Stephania epigaea H.S. Lo）、罕好帕（石菖蒲Acorus tatarinowii Schott）、反帕嘎[苦菜子Brassica integrifolia（West）O. E. Schulz]組成。其中姜黃、紫色姜性溫?zé)?，入風(fēng)、土塔，具有通氣消脹、活血止痛之功，為主藥;石菖蒲性熱，入風(fēng)、水、土塔，主治脘腹脹痛，不思飲食，為輔助藥;地不容、苦菜子味苦，性涼，既有涼血止痛之功，還可抑制主藥之燥性，為抑制藥[1]。在功能主治方面，傣醫(yī)認(rèn)為雙姜胃痛丸能“通塞勒，塞攏，補(bǔ)塔鈴。兵接崩接短，短嘎習(xí)不利惡來(lái)”，即“理氣止痛，和胃降逆”，主治中焦氣滯所致胃脘痞滿脹痛，噯氣吞酸，以及慢性淺表性胃炎見上述證候者[2]。本研究采用熱板法和甲醛足底注射致痛法，研究雙姜胃痛丸全方的鎮(zhèn)痛作用，并探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，SPF級(jí)，雌雄均有，體重18～22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2013-24。實(shí)驗(yàn)用小鼠飼料及墊料，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)生物科技有限公司，許可證號(hào)：2016-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)駐動(dòng)物飼養(yǎng)房后，實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)方法及條件經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格。

1.2 試劑和儀器 雙姜胃痛丸（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：170117）。20倍體積75%乙醇浸泡過(guò)夜后充分研磨，濾去殘?jiān)?，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后減壓干燥，4 ℃保存，用前以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制。阿司匹林腸溶片（50 mg，湖南亞大制藥有限公司，批號(hào)：20160401），用前以0.5% CMC-Na配制。腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒（20190520）、5-羥色胺（HT）檢測(cè)試劑盒（20190422）、前列腺素（PG）E2（20190710）、谷氨酸（Glu）（20190515）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

電子天平（ALC2104，北京賽多利斯天平有限公司），酶標(biāo)儀（1500，Thermo Fisher），智能熱板儀（RB-200，成都泰盟科技有限公司），型恒溫水浴鍋（HH-6，國(guó)華電器有限公司），MyCycler PCR儀、MyiQ梯度單色實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) ① 熱板法：取雌性小鼠40只，隨機(jī)分成空白組（0.5% CMC-Na）、陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林，0.2 g/kg）和SJWT低、中、高劑量組（0.75 g生藥/kg、1.50 g生藥/kg、3.00 g生藥/kg）共5組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前測(cè)定各組小鼠給藥前痛閾值即基礎(chǔ)痛閾值。實(shí)驗(yàn)開始每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天。末次給藥后30、60、90min分別測(cè)定各鼠的痛閾值1次。超過(guò)60 s 未出現(xiàn)痛反應(yīng)者，即刻停止實(shí)驗(yàn)，痛閾值以 60 s 計(jì)算。

② 甲醛致痛法：取小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分成空白組（0.5% CMC-Na）、模型組（0.5% CMC-Na）、陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林，0.2 g/kg）和雙姜胃痛丸低、中、高劑量組（0.75 g生藥/kg、1.50 g生藥/kg、3.00 g生藥/kg）共6組，每組8只。末次給藥后2 h，除空白組外，各組小鼠右后足底行皮下注射以2.5%甲醛溶液25 μL/只。注射后將小鼠置 2000 ml燒杯中，分兩個(gè)時(shí)相（Ⅰ相，0～5 min，早發(fā)相）和（Ⅱ相，10～30 min，遲發(fā)相）觀察記錄小鼠舔、咬右后足的累計(jì)時(shí)間并計(jì)算疼痛抑制率。疼痛抑制率=（模型組舔足累計(jì)時(shí)間-給藥組舔足累計(jì)時(shí)間）/模型組舔足累計(jì)時(shí)間×100%。

1.3.2 鎮(zhèn)痛機(jī)制研究 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)②觀察結(jié)束后處死小鼠，取腦組織和右后足，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取小鼠腦組織，加生理鹽水制成10%勻漿液，4 ℃，3000 rpm離心10 min，取上清液，按檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明，測(cè)定5-HT和Glu含量。分離小鼠右后足組織，冰上剪碎，取適量組織加生理鹽水勻漿，4 ℃，3000 rpm離心10 min，取上清液，測(cè)定PGE2和TNF-α含量。

另取右后足組織適量，Trizol試劑一步法提取總RNA，采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42 ℃溫育60 min，70 ℃加熱10 min后終止反應(yīng)，冰浴冷卻，得cDNA第一鏈。采用SYBR green PCR試劑盒，優(yōu)化反應(yīng)條件：預(yù)變性，50 ℃，2 min;95 ℃，10 min;變性，95 ℃，15 s;退火/延伸，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95 ℃：15 s;60 ℃：30 s;95 ℃：15 s。反應(yīng)結(jié)束，提取各基因Ct值，2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。MCP-1引物根據(jù)PubMed查詢對(duì)應(yīng)物種目的基因mRNA序列，以CDS序列設(shè)計(jì)，序列見表1。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析處理，以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s）表示，采用單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)預(yù)先用Homogeneity of Variances進(jìn)行方差齊性分析，方差齊則進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，方差不齊則進(jìn)行Tamhanes T2檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 雙姜胃痛丸對(duì)熱刺激小鼠痛閾的影響 灌胃給藥1周后，阿司匹林在末次給藥后30 min、60 min能顯著提高小鼠熱刺激體表的痛閾值;雙姜胃痛丸在末次給藥后60 min能顯著提高小鼠熱刺激體表的痛閾值。具體見表2。

2.2 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠痛反應(yīng)的影響 右后足底注射甲醛后，模型組小鼠出現(xiàn)明顯舔足、咬足反應(yīng)。與模型組相比，阿司匹林組及雙姜胃痛丸高劑量組小鼠Ⅰ時(shí)相舔足、咬足累計(jì)時(shí)間減少，疼痛抑制率增加;阿司匹林組及雙姜胃痛丸低、中、高劑量組小鼠Ⅱ時(shí)相舔足、咬足累計(jì)時(shí)間均顯著減少，疼痛抑制率增加，且雙姜胃痛丸的作用表現(xiàn)出劑量依賴性。具體見表3。

2.3 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠炎癥反應(yīng)的影響 對(duì)小鼠甲醛注射足組織中炎性因子含量的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，甲醛注射模型組小鼠足組織中TNF-α和PGE2含量顯著升高，MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著升高。阿司匹林和雙姜胃痛丸中、高劑量均能顯著降低甲醛注射足組織中TNF-α含量，阿司匹林和雙姜胃痛丸低、中、高劑量均能顯著降低甲醛注射足組織中PGE2含量和MCP-1mRNA表達(dá)量，且雙姜胃痛丸的作用表現(xiàn)出劑量依賴性。具體見表4。

2.4 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠腦組織疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響 對(duì)甲醛致痛小鼠腦組織疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的結(jié)果見表5。結(jié)果顯示， 甲醛致痛模型小鼠腦組織中5-HT含量較對(duì)照組升高，雙姜胃痛丸高劑量對(duì)小鼠腦組織5-HT的含量有上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。甲醛致痛小鼠腦組織中Glu含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，雙姜胃痛丸各劑量對(duì)Glu含量無(wú)顯著影響。阿司匹林對(duì)小鼠腦組織中5-HT和Glu含量均無(wú)明顯影響。具體見表5。

3 討論

傣藥經(jīng)方雙姜胃痛丸由姜黃、紫色姜、地不容、石菖蒲、苦菜子組成，全方可理氣止痛，和胃降逆。已有的研究證實(shí)，姜黃及其主要活性成分姜黃素[3-4]，地不容及其主要活性部位總生物堿[5-6]，均有確切的抗炎鎮(zhèn)痛作用，但關(guān)于全方鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制的鮮有系統(tǒng)報(bào)道[7]。本研究分別選取熱板法復(fù)制經(jīng)典熱刺激致痛模型，選取甲醛足底注射致痛法模擬急性組織損傷所致的持續(xù)性炎性疼痛，考察雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。其中，甲醛致痛模型Ⅰ相反應(yīng)由于直接刺激外周神經(jīng)所致，而Ⅱ相反應(yīng)則主要由炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放所致[8]。研究發(fā)現(xiàn)，雙姜胃痛丸中劑量能提高熱刺激小鼠的痛閾值，高劑量能縮短甲醛致痛小鼠的Ⅰ相舔、咬足時(shí)間，疼痛抑制率為28.38%;低、中、高劑量組均能顯著縮短甲醛致痛小鼠的Ⅱ相舔、咬足時(shí)間，疼痛抑制率分別為21.39%、27.02%和42.42%，提示雙姜胃痛丸既能通過(guò)抑制神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，也能抑制炎癥反應(yīng)引發(fā)的炎性疼痛，且后者作用優(yōu)于前者。

炎性疼痛可由創(chuàng)傷、感染、化學(xué)刺激（如甲醛、醋酸）、外科手術(shù)操作等導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)所引發(fā)。在此過(guò)程中，包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞活化并表達(dá)、釋放出細(xì)胞因子、趨化因子及其他生理活性物質(zhì)，如白介素（IL）-6、IL-1、TNF-α、MCP-1、PGE2等。其中，TNF-α和PGE2既是炎癥介質(zhì)，又是致痛物質(zhì)，且PGE2增加可引起痛覺過(guò)敏和痛覺超敏發(fā)生[9-10]。趨化因子超家族成員MCP-1在炎癥反應(yīng)過(guò)程中大量產(chǎn)生，可通過(guò)誘導(dǎo)中樞敏化，在炎性疼痛的產(chǎn)生和維持過(guò)程發(fā)揮重要作用，對(duì)大鼠痛覺行為有易化作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，雙姜胃痛丸可明顯降低小鼠甲醛注射后足組織中PGE2含量、TNF-α含量和MCP-1mRNA表達(dá)水平，提示雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠的Ⅱ相疼痛反應(yīng)的抑制作用，與減少炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)及痛覺易化物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)均參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛行為，前者以5-HT、多巴胺等為代表，后者主要包含以Glu為代表的興奮性氨基酸和以γ-氨基丁酸為代表的抑制性氨基酸[12-13]。本研究表明，雙姜胃痛丸各劑量對(duì)小鼠大腦組織中5-HT和Glu含量無(wú)明顯影響。

綜上所述，雙姜胃痛丸對(duì)熱刺激致痛、甲醛致痛模型Ⅰ相疼痛反應(yīng)和Ⅱ相疼痛反應(yīng)均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用，相同劑量下對(duì)甲醛注射引起的Ⅱ相疼痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)。在甲醛致痛模型，雙姜胃痛丸顯著降低甲醛注射組織中炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)PGE2和TNF-α含量，降低疼痛易化介質(zhì)MCP-1的表達(dá)，而對(duì)腦組織中與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu均無(wú)明顯影響，提示雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用與減少炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)及痛覺易化物質(zhì)的釋放有關(guān);雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用是否會(huì)在更高劑量表現(xiàn)出對(duì)熱刺激致痛及甲醛的致痛模型Ⅰ相反應(yīng)階段表現(xiàn)出劑量依賴性，以及其可能的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-04-07 編輯：劉 斌）