陳思鍇 林盛杰 李 理

(1. 華南理工大學(xué)，廣東 廣州 510642；2. 廣州市白云聯(lián)佳精細(xì)化工廠，廣東 廣州 510445)

脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要成分，構(gòu)成了細(xì)胞邊界，可以儲存能量并參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)過程[1-2]。對于哺乳動物而言，酵母菌的脂質(zhì)組成相對簡單，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因所占比例相對較高，分子遺傳分析手段較為成熟，使得酵母在脂質(zhì)研究中備受關(guān)注[1]。釀酒酵母是研究真核生物脂質(zhì)調(diào)控機(jī)制的主要模型生物[3]，耶氏解脂酵母能代謝多種底物并轉(zhuǎn)化成生物脂質(zhì)[4]，斯達(dá)氏油脂酵母[5]等產(chǎn)油酵母側(cè)重于對甘油酯的代謝分析，酵母脂質(zhì)組學(xué)研究缺乏對其他酯類物質(zhì)和酰胺類化合物的關(guān)注。據(jù)報(bào)道[6-7]，馬克斯克魯維酵母和庫德里阿茲威畢赤酵母可應(yīng)用于生產(chǎn)生物脂質(zhì)，但試驗(yàn)所分離的大部分菌種目前未見其脂質(zhì)方面的研究。

生物樣品中脂質(zhì)種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，故脂質(zhì)組學(xué)分析需要借助先進(jìn)的分離技術(shù)和檢測手段[8]。近年來，基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)研究提高了對細(xì)胞脂質(zhì)生物學(xué)的認(rèn)識，但脂質(zhì)的定性定量問題仍是制約脂質(zhì)組學(xué)發(fā)展的主要障礙。超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)能將液相的強(qiáng)分離效果和質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨率以及快速檢測的優(yōu)勢良好地結(jié)合起來[9]，能對生物體內(nèi)脂質(zhì)種類和含量進(jìn)行監(jiān)測，是目前脂質(zhì)組學(xué)研究的一種重要手段。研究擬從腐乳廠的酸漿水和毛胚中分離鑒定出多個(gè)酵母菌株，著重于酵母的產(chǎn)酶特性分析，并利用UHPLC-MS/MS對其中7個(gè)菌株的脂質(zhì)組成進(jìn)行非靶向定性分析，研究酵母菌的脂質(zhì)組成，旨在為酵母的生產(chǎn)應(yīng)用以及脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

腐乳毛胚、酸漿水：廣東某腐乳廠；

阿米塞畢赤酵母(PichiaamenthioninaY)：實(shí)驗(yàn)室前期從豆腐酸漿水中分離純化得到；

馬克斯克魯維酵母(KluyveromycesmarxianusK)：科漢森公司；

酵母DNA快速提取試劑盒：廣州東盛生物科技有限公司；

氯仿、甲醇：色譜純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜：UHPLC-/Q-Exactive Plus型，美國Thermo scientific公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR22G型，日本日立公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-5500PC型，上海元析儀器有限公司；

醫(yī)用離心機(jī)：JW-HR型，安徽嘉文儀器裝備有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司；

紫外凝膠成像系統(tǒng)：WD-9413B型，廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司；

基因擴(kuò)增儀：TR-96/G/H(b)C型，杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母分離純化和鑒定

(1) 酵母菌株的分離純化：分別取1 mL豆腐酸漿水和1 g腐乳毛胚于9 mL無菌生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋，選擇適宜梯度的稀釋液1 mL涂布于YPD平板中，再于28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取疑似酵母菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)并劃線分離，如此反復(fù)3～4次，直至獲得純的單菌落，將劃線分離得到的菌株保藏于50%的甘油溶液中，并于-20 ℃保存。

(2) 分子生物學(xué)鑒定：對分離獲得的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用酵母DNA快速提取試劑盒提取酵母菌的基因組DNA，然后設(shè)計(jì)ITS序列通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增得到的 DNA進(jìn)行測序，并在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST 比對。

1.2.2 脂肪酶活測定

(1) 粗酶液的制備：將過夜活化的酵母菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，離心獲得酵母菌體，用無菌水洗滌2次，獲得酵母種子液，調(diào)節(jié)菌液濃度為108CFU/mL，按體積分?jǐn)?shù)1%接種于20 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，離心，測定上清液脂肪酶活。菌體用無菌水洗滌后，重懸于無菌水中，調(diào)節(jié)菌液OD600 nm值為2.5，作為粗酶液用于測定細(xì)胞結(jié)合型的脂肪酶活。

(2) 酶活測定：參照GB/T 23535—2009并修改。試驗(yàn)組錐形瓶中加入 4 mL 4%聚乙烯醇溶液和 5 mL pH 7.5 的磷酸緩沖液，37 ℃保溫5 min，再加入 1 mLOD600 nm為2.5的酵母菌液或培養(yǎng)基上清液，混勻，37 ℃保溫30 min，隨后加入15 mL乙醇(95%)終止反應(yīng)。用NaOH溶液(0.026 mol/L)滴定至中性，記錄消耗NaOH溶液體積。對照組則先加入乙醇溶液終止反應(yīng)，再加入酶液。

1.2.3 脂質(zhì)組成分析

(1) 酵母培養(yǎng)及脂質(zhì)的提取：將過夜活化的菌液按體積分?jǐn)?shù)1%接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，再次離心收集菌體，凍干保存。取0.12 g凍干的酵母菌體于帶螺旋蓋的玻璃試管中，再加入2 mL氯仿—甲醇(1∶1)溶液，渦旋提取1 min。加入2 mL 0.8 mol/L的KOH—甲醇溶液，42 ℃、160 r/min下孵育30 min。加入5 mL氯仿和2.25 mL 水渦旋直至皂化，3 000 r/min離心10 min，取下層有機(jī)相過有機(jī)膜進(jìn)樣檢測[10]。

(2) UHPLC-ESI-MS/MS：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，質(zhì)譜系統(tǒng)為配備ESI離子源和Orbitrap的API14000質(zhì)譜儀。色譜分離采用二元的梯度洗脫，溶劑A為添加0.1%甲酸的水溶液；溶劑B為甲醇；流速300 μL/min，進(jìn)樣量2 μL。洗脫梯度為0 min，85% B；2 min，85% B；20 min，100% B；22 min，100% B；22.1 min，85% B。正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析，掃描范圍150～10 000。所有譜圖數(shù)據(jù)處理采用X caliber 2.0軟件分析，并與MZcloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對確定物質(zhì)的相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

由表1可知，酸漿水體系中共分離得到10個(gè)酵母菌株，除了1株膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)ATW-6外，其他的9個(gè)菌株均為嗜酒假絲酵母(Candidaethanolica)，說明嗜酒假絲酵母的耐酸性較好，酸漿水過酸的環(huán)境不適宜其他酵母的生長。嗜酒假絲酵母也存在于紅茶菌[11]、新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳[12]、龍舌蘭酒[13]等食品中。膜醭畢赤酵母主要應(yīng)用于柑橘青綠霉病的控制，通過與病原菌進(jìn)行營養(yǎng)和空間競爭，誘導(dǎo)果樹產(chǎn)生抗病性[14]。

表1 腐乳酸漿水中酵母分離菌株鑒定結(jié)果

由表2可知，毛胚中共分離得到13個(gè)菌株，包括3株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、3株Diutina(Candida)mesorugosa、2株庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)、3株挪威畢赤(Pichianorvegensis)和2株阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)。馬克斯克魯維酵母已通過美國GRAS和歐洲QPS安全認(rèn)證[15]，可在高達(dá)45～52 ℃的溫度下生長，其碳源代謝譜十分廣泛[16]。該菌種在面包生產(chǎn)中具有一定研究和應(yīng)用價(jià)值，能夠改善發(fā)酵面包的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)[17-18]。庫德里阿茲威氏畢赤酵母在西非一種自然發(fā)酵的面團(tuán)Mawe中是優(yōu)勢菌種[19]，該菌種也存在于豬肉腸、芝士、葡萄酒渣、可可豆和米糠中[20]。Hong等[21]發(fā)現(xiàn)，庫德里阿茲威氏畢赤酵母SJP-SNU含有致病性相關(guān)基因，但未見其致病性報(bào)道，同時(shí)含有植酸酶和纖維素酶基因，該菌株的益生特性和安全性需進(jìn)一步研究。P.kudriavzeviiMF-121[21]和P.kudriavzeviiDMKU 3-ET15[22]在高溫條件下也能高產(chǎn)乙醇，其MF-121菌株對酸、乙醇、溫度、鹽均具有較高的耐受性[23-24]。Hellstr?m等[25]從一種坦桑尼亞的發(fā)酵食品中分離得到挪威畢赤酵母；且發(fā)酵初期的挪威畢赤酵母占其中非釀酒酵母的14%[26]。Diutina(Candida)mesorugosa與某些感染性疾病相關(guān)[27]。阿薩希毛孢子菌是一種罕見的條件性真菌病原體，可導(dǎo)致免疫缺陷患者發(fā)生系統(tǒng)性感染，甚至對嗜中性粒細(xì)胞減少的患者具有生命威脅[28-29]

表2 腐乳毛胚中酵母分離菌株鑒定結(jié)果

考慮到菌種的安全性和差異性，從分離的23株菌株中各選擇1株嗜酒假絲酵母ATW-1、膜醭畢赤酵母ATW-6、馬克斯克魯維酵母SP-1、庫德里阿茲威畢赤酵母SP-4和挪威畢赤酵母SP-5共5株酵母菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并選取實(shí)驗(yàn)室前期分離的阿米塞畢赤酵母(Pichiaamenthionina)Y和商業(yè)菌株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)K進(jìn)行對比。前期研究[30]表明，阿米塞畢赤酵母Y(Pichiaamenthionina)對溫度和NaCl具有較高的耐受性，能降低大豆豆腥味成分，產(chǎn)生酯類香氣成分。

2.2 脂肪酶酶活

由圖1可知，菌株ATW-6、SP-4、SP-5與K的上清液脂肪酶酶活顯著高于其他3個(gè)菌株，為2.08～2.83 U/mL，菌株ATW-1與菌株Y的上清液基本無脂肪酶酶活。胡珺等[31]發(fā)現(xiàn)，未優(yōu)化產(chǎn)酶條件前，芽孢桿菌酶活僅為2.17 U/mL?？莶菅挎邨U菌U5脂肪酶酶活為3.30 U/mL，優(yōu)化后可達(dá)4.30 U/mL[32]。菌株ATW-6的上清液酶活最高，為2.83 U/mL，與上述提到的芽孢桿菌進(jìn)行對比，其優(yōu)勢比較突出。就細(xì)胞結(jié)合型脂肪酶活而言，菌株ATW-1、SP-4和Y的酶活高于其他菌株，基本處于1.70 U/mL左右，說明上清液脂肪酶酶活與細(xì)胞結(jié)合型脂肪酶活之間不存在必然聯(lián)系。

2.3 脂質(zhì)非靶向分析

由圖2可知，菌株ATW-1、ATW-6、SP-4、Y和K的峰位置和強(qiáng)度較為接近，0.98，6.36，8.09 min處的相對響應(yīng)較強(qiáng)。而菌株SP1、SP5的中間離子峰信號較弱，說明這兩株酵母與其他酵母的脂質(zhì)組成存在差異。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 酵母提取物的UHPLC-MS/MS總離子流圖

由圖3可知，酵母脂質(zhì)化合物包括2種鞘氨醇、16種酰胺、22種酯類、3種脂肪酸4大類物質(zhì)。酰胺是以長鏈脂肪酸酰胺為主；酯類主要包括長鏈脂肪酸甲酯、芳香酯類和單甘油酯3大類；脂肪酸包括二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和α-亞麻酸3種。其中，酯類是酵母脂質(zhì)的主要組成成分，同時(shí)菌株ATW-1、SP-4與Y檢測出的酯類物質(zhì)相對多于其他菌株。這3個(gè)菌株的上清液脂肪酶活較低，但其細(xì)胞結(jié)合型脂肪酶活卻較高，與其代謝產(chǎn)物中存在較為豐富的酯類物質(zhì)似乎有一定的相關(guān)性。

X1. N,N-二甲基鞘氨醇 X2. 鞘氨醇 X3. 十六酰胺 X4. 硬脂酰胺 X5. 油酸酰胺 X6. 煙酰胺 X7. 芥酸酰胺 X8. 二十二酰胺 X9. α-亞麻酸乙醇酰胺 X10. 脯氨酸酰胺 X11. 油酰乙醇酰胺 X12. N，N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺 X13. 十八碳四烯酰甘氨酸 X14. N-乙酰腐胺 X15. N1-乙酰精胺 X16. 戊基芬太尼 X17. 油酰苯胺 X18. N8-乙酰亞精胺 X19. 9(Z),11(E),13(E)-十八碳三烯酸甲酯 X20. 三(2,4-二叔丁基)亞磷酸苯酯 X21. 十六烯酸甲酯 X22. 鄰苯二甲酸二甲酯 X23. 棕櫚酸甲酯 X24. 順式-12-十八酸甲酯 X25. 蓖麻油酸甲酯 X26. 3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸正十八烷醇酯 X27. 新蛇床內(nèi)酯 X28. 鄰苯二甲酸二異丁酯 X29. 二十二碳六烯酸甲酯 X30. 異煙酸甲酯 X31. 濱蒿內(nèi)酯 X32. 魯望素 X33. 4-羥基香豆素 X34. 2-花生酰甘油酯 X35. 1-硬脂酰甘油酯 X36. 2-亞油酸甘油酯 X37. 紐甜 X38. 鱷梨酸1-乙酸酯 X39. 2-(14,15-環(huán)氧二十碳三烯?；? 甘油酯 X40. PPG Acrylate n10 X41. 二十碳五烯酸 X42. 二十二碳六烯酸 X43. α-亞麻酸

由圖4可知，前3個(gè)主成分的積累方差貢獻(xiàn)達(dá)到了71.5%?；谇皟蓚€(gè)主成分可知，菌株SP-4、ATW-1、Y和K的位置較為接近，位于第1組分的負(fù)端和第2組分的正端，說明樣品組成較為相似，與TIC圖一致；而菌株SP1、SP5、ATW-6則分別分布于第1、第4和第3象限，說明與其他菌株脂質(zhì)組成差異較大。

圖4 主成分分布圖

2.4 鞘氨醇代謝分析

7株酵母菌株中均存在N,N-二甲基鞘氨醇和植物鞘氨醇。鞘氨醇屬于鞘脂化合物，是合成神經(jīng)酰胺的前體物質(zhì)[33]，而鞘脂在哺乳動物角質(zhì)層的保水性和表皮通透性屏障功能中發(fā)揮著重要作用[34]。

由圖5可知，馬克斯克魯維酵母SP-1中植物鞘氨醇相對含量最高，其次為挪威畢赤酵母SP-5。植物鞘氨醇是較為常見的一種鞘氨醇，解脂假絲酵母(Candidalipolitica)33M菌株所產(chǎn)神經(jīng)酰胺主要是以18碳和20碳的植物鞘氨醇與脂肪酸?；纬蒣35]，酵母神經(jīng)酰胺的磷酸肌醇衍生物均以含植物鞘氨醇基的鞘磷脂化合物為主[36]。挪威畢赤酵母SP-5中N,N-二甲基鞘氨醇相對含量最高，其次為SP-1。N,N-二甲基鞘氨醇是氨基上的氫被兩個(gè)甲基取代而形成，二甲基鞘氨醇不但是一種蛋白激酶C的抑制劑，也是特異性的鞘氨醇激酶抑制劑，其抗癌作用已成為化療發(fā)展的基礎(chǔ)。由于鞘氨醇及其衍生物種類和結(jié)構(gòu)的多樣性，不同培養(yǎng)條件、酵母菌中鞘脂的種類也存在差異[37-38]，酵母菌株中極有可能存在其他未知結(jié)構(gòu)的鞘脂類化合物。

圖5 酵母中植物鞘氨醇和N,N-二甲基鞘氨醇的相對響應(yīng)

3 結(jié)論

從豆腐酸漿水和腐乳毛胚中共分離得到23個(gè)菌株，利用ITS測序技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果表明，酸漿水中分離得到1株膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)和9株嗜酒假絲酵母(Candidaethanolica)；毛胚中分離得到3株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、3株Diutina(Candida)mesorugosa、2株庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)、3株挪威畢赤酵母(Pichianorvegensis)和2株阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii)。通過對酵母菌脂肪酶活和脂質(zhì)組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株ATW-1、SP-4和Y的細(xì)胞結(jié)合型脂肪酶活高于其他菌株，同時(shí)菌株ATW-1、SP-4和Y中的酯類物質(zhì)相對比較豐富，PCA分析進(jìn)一步表明這3個(gè)菌株脂質(zhì)組成具有一定相似性。酵母菌中豐富的代謝酯類物質(zhì)可能與細(xì)胞結(jié)合型脂肪酶之間存在密切聯(lián)系，與上清液的脂肪酶酶活力無關(guān)。馬克斯克魯維酵母SP-1和挪威畢赤酵母SP-5中鞘氨醇相對響應(yīng)較高，推測這兩個(gè)菌株在鞘脂合成方面具有一定研究潛力，后續(xù)可進(jìn)行鞘脂的定量分析，充分挖掘酵母中豐富的脂質(zhì)資源。