石磊 李軍祥 韓嘯 劉佳麗 路瓊瓊 寇富舜 孫中美 丁龐華 毛堂友 王志斌

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性炎性結(jié)直腸疾病，主要影響18～50歲的中青年，有腹瀉、黏液膿血便和腹痛等癥狀。因本病難治愈、易復(fù)發(fā)、癌變風(fēng)險高，UC已被世衛(wèi)組織列為難治病。近年來，除常規(guī)治療藥物外，又新增了如：糞菌移植[1]、選擇性白細(xì)胞吸附[2]等技術(shù)手段，但以上藥物或療法具有療效不穩(wěn)定、停藥后易復(fù)發(fā)、不同程度的毒副作用、價格較貴等問題。中醫(yī)藥在誘導(dǎo)緩解、協(xié)同西藥增效減毒、提高生活質(zhì)量、預(yù)防復(fù)發(fā)等方面有較明顯優(yōu)勢[3]。

清腸溫中方是課題組帶頭人李軍祥在繼承董建華院士學(xué)術(shù)思想下，根據(jù)多年臨床總結(jié)而成，特提出其病機屬脾陽不足、濕熱內(nèi)蘊、瘀血內(nèi)阻，治以溫中健脾、清熱燥濕、涼血化瘀。前期課題組在單中心的雙盲雙模擬RCT臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，本方具有改善輕、中度活動期UC患者臨床癥狀、降低疾病活動度并提高生活質(zhì)量的療效；動物實驗也證實了該方具有減輕炎癥、修復(fù)黏膜病變的作用。

為了進(jìn)一步揭示本方的功效，本研究遵循“法依病機，拆方依法”的研究思路，將清腸溫中方根據(jù)病機拆分為：溫中健脾的炮姜、炙甘草；清熱燥濕的黃連、青黛、苦參；涼血化瘀的三七、木香、地榆炭，并將以上三者兩兩組合，開展清腸溫中方的拆方研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠79只，體重(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK(京)2016-0002)，常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，12小時光照/黑夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%，自由飲食飲水飼養(yǎng)。實驗過程符合北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會實驗動物倫理分委員會制訂的倫理要求。

1.2 主要試劑儀器

葡聚糖硫酸鈉(0216011080，美國MP Biomedical)；大鼠IP10 Elisa試劑盒(CSB-E08182r，武漢華美生物工程有限公司)；大鼠CXCR3 Elisa試劑盒(JL13105，上海江萊生物科技有限公司)；小鼠抗HIF-1α單克隆抗體(ab1，美國Abcam)；小鼠抗Cytokeratin8單克隆抗體(ab9023，美國Abcam)；兔抗Vimentin單克隆抗體(ab92547，美國Abcam)；酶標(biāo)儀(MultiSkan3；美國Therno scientific)；電泳儀(Mini Ge Tank，美國Therno scientific)；轉(zhuǎn)膜儀(Mini Blot Module，美國Therno scientific)；病理切片機(LEICA2016，德國Leica)；顯微鏡(XSP-C204，上海巨納科技有限公司)等。

1.3 實驗用藥

陽性對照藥：美沙拉秦緩釋顆粒(艾迪莎)，批號：170506，規(guī)格：0.5 g/袋。

中藥：清腸溫中方顆粒劑(黃連6 g、炮姜10 g、青黛3 g、苦參15 g、三七6 g、煨木香6 g、地榆炭15 g、炙甘草3 g)，由北京康仁堂公司生產(chǎn)加工，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院提供。

1.4 拆方分組

根據(jù)病機將清腸溫中方進(jìn)行拆方、重組，具體分組：(1)溫中健脾組：炮姜、炙甘草，兩藥合用起到溫中健脾，溫補中焦之用；(2)清熱燥濕組：黃連、青黛、苦參，共奏清熱燥濕之效；(3)涼血化瘀組；三七、木香、地榆炭，功效涼血化瘀，行氣止痛；(4)溫中健脾合清熱燥濕組：炮姜、炙甘草、黃連、青黛、苦參；(5)溫中健脾合涼血化瘀組：炮姜、炙甘草、三七、木香、地榆炭；(6)清熱燥濕合涼血化瘀組：黃連、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭；(7)全方組：清腸溫中方全方，炮姜、炙甘草、黃連、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭。

1.5 模型建立

所有大鼠于SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將79只大鼠采用隨機數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機分組，共分10組，其中空白組7只，模型組、溫中健脾組、清熱燥濕組、涼血化瘀組、溫中健脾合清熱燥濕組、溫中健脾合涼血化瘀組、清熱燥濕合涼血化瘀組、全方組和美沙拉秦組，每組8只。除空白組外，其余大鼠連續(xù)7天自由飲用4%(w/v)葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液以建立急性UC模型，飲用結(jié)束后，按不同的分組分別灌胃給藥7天，與此同時，除空白組外的所有大鼠，仍需繼續(xù)服用1% DSS溶液以維持小劑量刺激引起的病變[4]。

1.6 分組給藥

本研究選用前期實驗中效果最明顯的中劑量為給藥劑量(即臨床患者口服用藥的等效劑量)[4]。在實驗的后7天，各組大鼠以相應(yīng)藥物的中藥液或去離子水灌胃，每日1次，每次1 ml/100 g，具體用量：溫中健脾組：1.37 g 生藥/kg；清熱燥濕組：2.52 g 生藥/kg；涼血化瘀組：2.84 g 生藥/kg；溫中健脾合清熱燥濕組：3.89 g 生藥/kg；溫中健脾合涼血化瘀組：4.20 g 生藥/kg；清熱燥濕合涼血化瘀組：5.36 g 生藥/kg；全方組：6.72 g生藥/kg；美沙拉秦組：(美沙拉秦緩釋顆粒懸濁液)420.0 mg/kg。

1.7 標(biāo)本取材

灌胃給藥的第7天，所有大鼠禁食不禁水24小時，灌胃7天后于第8天取材。取材當(dāng)天稱重，按0.4mL/100g的劑量，腹腔注射10%水合氯醛溶液。腹主動脈抽取血液，靜置2小時后，4℃條件下3000 rpm離心15分鐘，留取淡黃色血清。留取數(shù)段腸管，PBS快速沖洗后，分別放于4%多聚甲醛和凍存管中，以進(jìn)行病理和蛋白學(xué)相關(guān)檢測。

1.8 結(jié)腸組織病理學(xué)評價

結(jié)腸組織在多聚甲醛固定24小時以上，經(jīng)過洗滌、修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片。二甲苯脫蠟、梯度酒精、蘇木精染色、分化、返藍(lán)、伊紅復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察評分。根據(jù)結(jié)腸組織學(xué)病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[5]計算總分。評分內(nèi)容分炎細(xì)胞浸潤程度、肉芽腫和病變深度，無記0分，輕度記1分，中度記2分，重度記3分。

1.9 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片抗原修復(fù)、兩步法染色，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片。樣本在高倍鏡視野(×200)白平衡后進(jìn)行拍照采圖，Image J軟件(National Institutes of Health, USA)分析圖像，計算光密度(IOD)和染色區(qū)域總面積(area)，IntDen表示陽性蛋白相對密度，以area表示陽性染色蛋白分布及表達(dá)總面積，用平均光密度(AOD=IntDen/area)統(tǒng)計分析。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附實驗

凍存血清室溫解凍，按照Elisa試劑盒說明步驟進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。

1.11 Western blot實驗

制備結(jié)腸組織勻漿、蛋白抽提、BCA定量、濃度調(diào)整、灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗反應(yīng)、二抗孵育、顯影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件定量，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參的相對密度值表示。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)病變程度的影響

模型組可見炎細(xì)胞浸潤、腺體萎縮和黏膜結(jié)構(gòu)破壞，治療后清熱燥濕、溫中健脾聯(lián)合清熱燥濕、溫中健脾合涼血化瘀、全方和美沙拉秦組均能緩解組織學(xué)病變并降低病變評分見圖1、表1。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖1 各拆方組大鼠HE染色組織學(xué)光鏡下腸黏膜組織病理圖(200×)

表1 各拆方組大鼠組織學(xué)病變評分表

2.2 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠腸黏膜中細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)影響

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，大鼠腸黏膜中波形蛋白(VIM)表達(dá)量較多，而模型組表達(dá)量更多，均成強陽性染色，從AOD值來看，除溫中健脾和溫中健脾合涼血化瘀組外，其余干預(yù)藥物均能減少其表達(dá)見圖2、表2。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖2 各拆方組大鼠腸黏膜中VIM蛋白的IHC染色圖(200×)

表2 各拆方組大鼠IHC染色值表

角蛋白8(K8)在各組大鼠腸黏膜中表達(dá)量整體偏低，模型組幾乎未見到陽性表達(dá)，治療后除清熱燥濕和清熱燥濕合涼血化瘀組，其余藥物均能促進(jìn)表達(dá)，且與模型組比較，存在統(tǒng)計學(xué)差異。見圖3。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖3 各拆方組大鼠腸黏膜中K8蛋白的IHC染色圖(200×)

此外，VIM/K8比值在DSS誘導(dǎo)的急性UC模型大鼠中明顯升高，經(jīng)各組藥物干預(yù)后，該比值均有下降見表2。

2.3 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠血清炎性介質(zhì)的含量影響

Elisa檢測各組大鼠血清中干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(IP10)和趨化因子受體3(CXCR3)后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠二者均明顯升高，除涼血化瘀組外，各拆方組干預(yù)后均能明顯減少血清中兩種炎性介質(zhì)的含量。其中，清熱燥濕、溫中健脾合涼血化瘀和溫中健脾合清熱燥濕組對IP10的下調(diào)作用更加明顯，效果優(yōu)于全方和美沙拉秦；溫中健脾合涼血化瘀和清熱燥濕合涼血化瘀組則能更多地減少血清CXCR3含量，其下降作用略優(yōu)于全方和美沙拉秦。見表3。

表3 各拆方組大鼠血清中炎性介質(zhì)含量表

2.4 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠結(jié)腸組織缺氧環(huán)境的影響

本研究采用Western blot檢測了各組大鼠結(jié)腸組織中的HIF-1α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然各組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異，但模型組HIF-1α表達(dá)趨勢高于空白組，各拆方組在治療后也有減少的趨勢，其中，以全方組減少作用最為明顯，其次為溫中健脾合涼血化瘀和溫中健脾合清熱燥濕組。見圖4、表4。

注：A：模型組；B：空白組；C：美沙拉秦組；D：全方組；E：清熱燥濕組；F：涼血化瘀組；G：溫中健脾組；H：溫中健脾合清熱燥濕組；I：清熱燥濕合涼血化瘀組；J：溫中健脾合涼血化瘀組。

圖4 各拆方組大鼠結(jié)腸組織中HIF-1α蛋白印跡圖

表4 各拆方組大鼠結(jié)腸HIF-1α相對灰度值表[p50 (p25～p75) ]

3 討論

UC病位在腸，與脾胃關(guān)系密切；病性屬本虛標(biāo)實，寒熱錯雜；本虛為脾陽不足，標(biāo)實為濕熱內(nèi)蘊夾有瘀血；病因病機或為外感濕熱，或為飲食不節(jié)，或為情志不暢，日久導(dǎo)致脾胃虛弱，運化失司，水濕內(nèi)停，濕郁化熱，濕熱內(nèi)蘊與腸道氣血相搏結(jié)，氣血凝滯，化為膿血，故見下利黏液膿血；腸道傳導(dǎo)失司，氣機阻滯，腑氣不通，出現(xiàn)腹痛、里急后重；脾胃虛弱，脾陽不足，溫煦失職，可有腹部冷痛，遇寒加重。

針對活動期UC，目前學(xué)術(shù)界多以清熱化濕和涼血止血為主要治療方法[6]，這一治法對泄瀉、便血類疾病雖是效如桴鼓，但由于UC發(fā)生時多已存在脾胃虛弱之況，一味使用苦寒、寒涼之藥只會徒增脾胃虛弱之累，甚至加重陽虛進(jìn)程，這也是為何臨床中活動期UC患者常伴有怕涼畏寒的原因之一；此外，涼血止血雖然能治療一時出血之癥，但對濕熱與氣血博結(jié)，同時存在脾陽虛弱的情況，單純的止血只會加重氣血瘀滯之勢，進(jìn)一步促使瘀血阻滯、新血不生，加重出血。因此結(jié)合臨床經(jīng)驗，課題組帶頭人李軍祥提出活動期UC中，濕熱與瘀血貫穿疾病始終，同時伴有脾陽不足，應(yīng)當(dāng)治以清熱燥濕、涼血化瘀、溫中健脾，并創(chuàng)立了清腸溫中方，這一理念的提出，也完全符合唐容川在《血證論》中提出的“止血、化瘀、寧血、補虛”的治血四法。

角蛋白以酸堿配對的形式構(gòu)成上皮細(xì)胞骨架中間絲，在腸上皮中主要表達(dá)為K8、K9、K19和波形蛋白(VIM)，不僅與各種結(jié)腸直腸疾病的發(fā)病有關(guān)，并且在維持上皮完整性方面發(fā)揮重要作用[9]。K8是上皮細(xì)胞早期分化的標(biāo)志,研究發(fā)現(xiàn)UC患者K8表達(dá)顯著下調(diào)，可能導(dǎo)致UC患者腸道上皮層的分化受抑制,上皮層變薄而加重病情[10]。另有研究指出K8在急性期增加，當(dāng)臨床和內(nèi)鏡提示緩解時，其表達(dá)可有所恢復(fù)[11]。研究發(fā)現(xiàn)UC患者的病變組織中，巨噬細(xì)胞激活也可導(dǎo)致VIM分泌增多[12]。因此在與上皮剝蝕和隱窩萎縮的相關(guān)疾病中，潛在的細(xì)胞骨架表型可能會表現(xiàn)為VIM：K8比例逐漸上升。本研究發(fā)現(xiàn)，急性UC模型大鼠中VIM表達(dá)明顯增多，K8表達(dá)明顯低于空白組，VIM/K8比值顯著增高，這與報道的變化規(guī)律相一致，經(jīng)拆方各組分干預(yù)后，均能顯著降低二者比值，且全方、溫中健脾合清熱燥濕和溫中健脾合涼血化瘀組的作用更加明顯。

IP10是內(nèi)源性趨化因子，抑制IP10可以減輕IL-10-/-誘導(dǎo)的自發(fā)性結(jié)腸炎小鼠炎癥程度[13]。研究發(fā)現(xiàn)UC患者的血清和結(jié)腸中IP10含量顯著升高[14]；IP10 / CXCR3軸在兒童IBD的發(fā)病中，也起到重要作用[15]，因此提出，抑制IP10可能會緩解UC的臨床癥狀。CXCR3是IP10的特異性結(jié)合蛋白，一旦與IP10結(jié)合后則被激活，并有助于其轉(zhuǎn)移到炎癥局部進(jìn)一步發(fā)揮效應(yīng)。而腸黏膜局部炎癥產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞因子[16]，不僅能刺激IP10招募更多的炎癥細(xì)胞形成級聯(lián)反應(yīng)，還能加重腸黏膜屏障的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)拆方各組分(除涼血化瘀組)均能降低IP10和CXCR3在血清中的表達(dá)含量，涼血化瘀或清熱燥濕組本身對降低CXCR3的效果相對較弱，但在聯(lián)合了溫中健脾治法后，就能明顯發(fā)揮降低炎性介質(zhì)的作用，發(fā)揮與全方相近的作用。

UC的出血和創(chuàng)面使血小板被大量激活，引起血小板黏附、聚集和高凝狀態(tài)；同時由于血管收縮、微血栓形成，造成整體和局部低氧的微環(huán)境，腸屏障功能受損[17]。此外，炎癥時局部血管通透性增強，更多的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，加重炎癥部位的局部缺氧[18]。而在低氧環(huán)境下，HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性都顯著增加[19]，最終導(dǎo)致UC黏膜中的高水平表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然各組間尚不存在統(tǒng)計學(xué)差異，但UC模型鼠的HIF-1α表達(dá)增高，經(jīng)藥物治療后，表達(dá)均有所減低，且以清熱燥濕合溫中健脾、涼血化瘀合溫中健脾及全方組的作用更為明顯，聯(lián)合組的藥效明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用溫中健脾、清熱燥濕或涼血化瘀。

《靈樞·百病始生篇》有云“邪不能獨傷人……兩虛相得，乃客其形”，強調(diào)了正氣在發(fā)病中起的主導(dǎo)作用。當(dāng)人體正氣不足，或邪氣的致病能力超過正氣的抗病限度時，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，即所謂的“邪之所湊，其氣必虛”。扶正，就是通過藥物或其他療法扶助機體的正氣，以增強體質(zhì)，提高機體抗邪能力的一種治療原則；祛邪，則是通過藥物或其他療法祛除或削弱病邪，減少邪氣侵襲和損害，達(dá)到邪去正安的目的[20]。一方面扶正可以扶益本源，調(diào)動人體的抗病能力并直接起到祛邪之用，所謂“養(yǎng)正則邪自安”；另一方面祛邪有利于扶正，只有祛除了病邪，正氣才可能迅速恢復(fù)，藥力才可能直達(dá)病所，所謂“閉門留寇”就是祛邪不足而成的，“瘀血去而新血生”也佐證了“邪去正安”的道理[21]。扶正祛邪是中醫(yī)治病的重要原則，二者是對立統(tǒng)一的，根據(jù)邪正消長及盛衰，決定治療的主次，扶正不留邪，祛邪不傷正，才能達(dá)到陰平陽秘的治療目標(biāo)。

在本次拆方研究中發(fā)現(xiàn)，只采用清熱燥濕或涼血化瘀的祛邪治法，無法對UC發(fā)揮滿意的治療效果，無法對其病理環(huán)節(jié)起到充分的調(diào)節(jié)作用，但清熱燥濕或涼血化瘀在聯(lián)合了溫中健脾的扶正藥物后，無論是從修復(fù)細(xì)胞骨架、減輕炎癥、改善缺氧環(huán)境三個單獨的環(huán)節(jié)，亦或是從整體來看，都能發(fā)揮與全方相當(dāng)?shù)闹委熥饔?。因此也提示在潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)藥治療中，顧護(hù)正氣、溫中健脾是必不可缺的原則。